甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎-腸炎模型的建立及驗證

杜寶香于欽輝孫啟慧王立清楊 勇容 蓉

(山東中醫藥大學,濟南 250355)

現代藥理研究發現,流感病毒感染肺組織并在內大量增殖,會造成嚴重的肺部炎癥損傷[1]。臨床數據表明,甲型H1N1流感患者早期表現與普通流感相似,包括發熱、咽痛、咳嗽、全身酸痛,部分病例表現為嘔吐、腹瀉[2]。Dogra[3]發現,與普通流感比較,甲型H1N1流感患者的腹瀉、嘔吐等胃腸道癥狀較為多見。繆媛媛等[4]曾對1200例普通流感與513例甲型H1N1流感患者的臨床癥狀進行比較研究,結果表明,甲型H1N1流感患者出現胃腸道癥狀者明顯增多。且甲型H1N1確診病例中腹瀉、嘔吐等胃腸炎癥狀多為呼吸道系統的伴隨癥狀。

目前對于小鼠H1N1病毒模型的建立多為單獨的肺炎模型[5-6],對于肺炎-腸炎模型的研究報道甚少。本文以BALB/c雄性小鼠為實驗動物,滴鼻感染不同濃度的H1N1病毒,篩選出造模的最佳感染濃度,并對其進行多次驗證,建立了穩定的肺炎-腸炎模型,為抗H1N1病毒藥物的研究提供更加全面的病理模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康SPF級雄性BALB/c小鼠36只(4周齡,15～18 g),由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。動物實驗在山東中醫藥大學抗病毒協同創新中心進行[SYKX(魯)2017-0022],飼養溫度(22±2)℃,相對濕度40%～60%,本研究實驗方案合理,經本院倫理委員會批準(DWSY202003013),符合實驗動物的“3R”原則研究。

1.1.2 病毒

甲型流感病毒H1H1/PR8株,-80℃保存于山東中醫藥大學抗病毒協同創新中心,使用前在9日齡SPF雞胚中擴增得到尿囊液,測定血凝效價。使用Reed-Muench法測定病毒毒力,-80℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司,批號:D18216041);RNA store樣品保存液-DP408、動物組織總RNA提取試劑盒-DP431(RNAprep Pure Tissue Kit)、cDNA反轉錄試劑盒-KR106、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒-FP205均購自天根公司。

ND-one超微量分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司);熒光定量PCR儀(CFX Connect Real-time System,美國伯樂公司);R583 S、R540IE型呼吸麻醉機(深圳瑞沃德生命科技有限公司);生物安全柜(上海立申科學儀器有限公司,型號:HF safe-1500);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司,型號:ST-16R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 流感病毒雞胚擴增

9～11日齡雞胚放置37℃孵育箱種孵育1 d,定時翻動雞胚。選擇生長良好雞胚,于生物安全柜內,畫出氣室邊界和胎位,在胚胎面與氣室交屆邊緣約1 mm處做標記。然后用消毒后的鑷子尖頭對準雞胚尿囊腔端打破蛋殼。取病毒液用流水沖浸融化,用生理鹽水稀釋成不同的濃度,每只雞胚接種0.1 mL。接種后用無菌棉膠帶封口,置于37℃繼續孵育48 h。用無菌吸管通過絨毛尿囊膜進入尿囊腔,吸取雞胚尿囊液,3000 r/min 4℃離心15 min,取上清于-80℃冰箱保存。用0.5%的雞紅細胞測定其血凝效價為1∶320。

1.3.2 Reed-Muench法測定病毒毒力

采用半對數稀釋法稀釋病毒,稀釋的病毒接種于96孔MDCK細胞板,待細胞病變停止后,根據Reed-Muench方法對病毒滴度進行計算,計算出病毒每0.1 mL的TCID50,經測定病毒TCID50=1×105/0.1 mL。

1.3.3 流感小鼠模型的建立

BALB/c小鼠按照體重和肛溫隨機分成4組(n=6):對照組、流感模型組(10 TCID50組、1 TCID50組、0.1 TCID50組)。3個模型組,按照組別分別滴鼻感染10 TCID50、1 TCID50、0.1 TCID50不同濃度的流感病毒,每只20 μL,對照組小鼠滴鼻接種等量的生理鹽水,每天記錄小鼠體重、肛溫變化,觀察小鼠的精神狀態、發病及死亡情況。處理后第7天處死小鼠進行取材。

1.3.4 造模指標觀察

(1)生理狀態觀察

接種病毒后,每日觀察小鼠肛溫、體重變化、大便形狀、隱血情況,連續7 d。并參照文獻[7]標準,進行DAI評分,評分標準見表1。

表1 DAI評分標準Table 1 DAI score standard

(2)死亡率

計算每組動物的死亡率:死亡率=死亡動物(只)/動物總數(只)×100%

(3)臟器指數

實驗結束后,摘取各組動物肺、胸腺、脾等臟器,準確稱量并計算臟器指數。

(4)RT-PCR檢測肺組織中甲型流感病毒H1N1 M基因及腸組織中ROR-γt的mRNA表達

使用RT-PCR檢測肺組織中甲型流感病毒H1N1 M基因及腸組織中ROR-γt的mRNA表達。根據小鼠死亡率、肺部病毒載量及腸道組織中ROR-γt的mRNA相對表達量確定最佳的染毒劑量。實驗中所需引物均由生工生物有限公司進行設計并合成。引物序列堿基見表2。嚴格按照試劑盒說明書完成總RNA的提取、RNA純度及濃度測定、RNA逆轉錄為cDNA及相關細胞因子基因相對表達量的檢測。

表2 基因序列Table 2 Sequences of the primers

1.3.5 造模結果驗證

BALB/c小鼠按照體重和肛溫隨機分成2組(n=6):對照組、模型組。根據1.3.2項方法,對模型組小鼠滴鼻感染H1N1病毒,感染劑量為上述實驗篩選出的最佳病毒劑量。取小腸及肺組織,進行HE染色。利用RT-PCR技術檢測肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、IL-17A及腸組織中GM-CSF、IL-2、IL-6和IL-33的mRNA相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件,數據以平均數±標準差(±s)表示,組件比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)LSD檢驗,P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 造模實驗結果

2.1.1 流感模型小鼠造模指標檢測

小鼠滴鼻感染流感病毒后,與對照組小鼠相比,小鼠10 TCID50組、1 TCID50組體重在接種病毒后第3天開始呈下降趨勢(圖1),出現背弓佝僂、精神不振和軟便等現象,在第6天開始兩組小鼠出現黏液狀糞便,平均DAI評分分別為(2.00±0.00)分和(1.50±0.12)分。而0.1 TCID50組小鼠體重直到第7天才出現下降趨勢,且糞便狀態一直正常。各組小鼠肛溫變化不明顯。

圖1 各組小鼠體重、肛溫和和DAI評分圖Figure 1 Body weight, rctal temperature DAI score in eachgroups

2.1.2 各組小鼠死亡率、臟器指數及肺組織中H1N1的M基因mRNA表達

接種病毒后,對照組、0.1 TCID50組小鼠無死亡現象,10 TCID50組小鼠、1 TCID50組小鼠均出現不同數量的死亡。10 TCID50死亡率為67%,1 TCID50組死亡率為17%。與對照組相比,各模型組小鼠肺指數明顯升高,胸腺指數明顯下降,脾指數無顯著性差異。以Ppia為管家基因,分析目的基因的相對表達。與對照組小鼠相比,各模型組小鼠甲型流感病毒H1N1 mRNA相對表達量顯著升高(P＜0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠死亡率、臟器指數和病毒載量Table 3 The mortality, organ index and viral load of different mice in each group

2.1.3 各組小鼠腸組織ROR-γt mRNA相對表達量

與對照組相比,10 TCID50組、1 TCID50組小腸組織ROR-γt相對表達量顯著升高(P＜0.05),0.1 TCID50組雖有升高趨勢,但是無顯著性差異(圖2)。綜合各組模型小鼠體重、死亡率、臟器指數、肺部病毒載量及腸道ROR-γt的mRNA相對表達量篩選出最佳染毒劑為1 TCID50。

2.2 造模驗證結果

2.2.1 小鼠肺與腸組織病理學指標檢測

HE染色結果見圖3。結果顯示對照組小鼠肺組織呈正常形態,黏膜上皮無變性壞死脫落,管壁及周圍組織無炎性細胞浸潤、肺泡間隔無增厚。模型組小鼠肺組織見壞死細胞及大量滲出物,周圍肺組織結構不清晰,嗜中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤,肺泡壁增厚;小腸組織同樣出現小腸絨毛萎縮斷裂,淋巴細胞浸潤等明顯的組織病理學改變,說明小鼠肺及腸道組織出現嚴重的炎癥損傷。

注:與對照組相比,*P＜0.05。圖2 各組小鼠ROR-γt基因相對表達量Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 2 The mRNA expression of ROR-γt in four groups

2.2.2 小鼠肺組織細胞因子的基因表達

與對照組相比,模型組小鼠肺組織中細胞因子IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的相對表達量均顯著升高,表明小鼠肺炎模型建立成功(圖4)。

2.2.3 小鼠腸組織細胞因子的基因表達

與對照組相比,模型組小鼠腸組織中細胞因子GM-CSF、IL-2的相對表達量顯著升高(P＜0.05、P＜0.01),表明小鼠腸炎模型建立成功,但IL-6和IL-33的表達量顯著降低(圖5)。

注:與對照組相比*P＜0.05, **P＜0.01。圖4 各組小鼠肺組織細胞因子相對表達量Note.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Relative expression of lung cytokines in different mice of each group

注:與對照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖5 各組小鼠小腸組織細胞因子相對表達量Note.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 5 Relative expression of intestine cytokines in different mice of each group

注:A:肺組織;B:小腸組織。圖3 各組小鼠組織病理形態觀察Note.A, Lung tissue.B, Intestine tissue.Figure 3 Histopathological changes of different mice tissues in each groups

3 討論

造模過程中,我們通過小鼠肺和小腸組織的炎癥損傷及DAI指數來評估小鼠胃腸型流感的嚴重程度。為了評估該模型是否建立成功,在本研究中,肺指數、肺部病毒載量以及肺組織中炎癥因子被用作肺炎模型的評價指標。DAI評分、小腸組織病理損傷及腸道炎癥因子的表達量被用作腸炎模型的評價指標。與對照組相比,若感染H1N1小鼠肺指數、肺部病毒載量以及肺和小腸中炎癥因子升高,DAI指數升高,且出現明顯的組織病理損傷,表明小鼠肺炎-腸炎模型成功建立。

造模過程中,模型組小鼠的體重呈現持續性下降趨勢,且小鼠出現精神萎靡、呼吸急促等現象,感染病毒后7 d,1 TCID50和10 TCID50組小鼠體重明顯低于對照組,但肛溫變化不明顯;小鼠肺、胸腺等臟器指數出現顯著性差異,但是脾指數變化不明顯;孫啟慧[8]以肺指數及H1N1基因相對表達量為指標成功建立流感模型,小鼠感染流感模型后,肺指數變大,肺組織H1N1基因相對表達量顯著升高(P＜0.01),因此肺部病毒載量及肺指數可以作為評估流感模型的一個重要指標。與對照組相比,1 TCID50和10 TCID50組小鼠腸組織變細、變短,腸道細胞因子ROR-γt顯著升高(P＜0.05),而ROR-γt作為Th17細胞等淋巴細胞的轉錄因子,當其表達升高時會誘導Th17細胞過度分泌IL-17、IL-22、GMCSF等炎癥因子,致使腸道免疫失調,造成炎癥損傷[9],因此選定ROR-γt的基因相對表達量為流感所致腸道炎癥損傷的指標。

各檢測數據顯示,小鼠滴鼻感染10 TCID50、1 TCID50濃度病毒后,造模結果較理想,但是,10 TCID50組小鼠死亡率過高,不利于實驗取材,且1 TCID50組小鼠ROR-γt基因相對表達量更高,綜合流感模型小鼠死亡率及腸道細胞因子表達情況確定感染劑量為1 TCID50。

對1 TCID50病毒感染劑量進行驗證,病理切片顯示模型組小鼠肺組織見壞死細胞及大量滲出物,周圍肺組織結構不清晰,炎性細胞浸潤,肺泡壁增厚。RT-PCR結果顯示,肺部炎癥因子IL-2、IL-6、IFN-γ及IL-17A顯著升高。IL-17是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子,可以通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應,IL-17與受體結合后,導致NF-κB靶基因及MAPK的激活,與IFN-γ產生協同作用,激活C/EPB,動員、募集及活化中性粒細胞,從而介導肺部組織炎癥[10-11]。

小腸病理切片顯示,模型組小鼠出現絨毛萎縮斷裂,淋巴細胞浸潤等病變,腸道炎癥因子GM-CSF和IL-2顯著升高,IL-6與IL-33顯著降低。IL-6是一種多效性細胞因子,在不同的組織及微環境中顯示出不同的作用,在炎癥方面,既具有促進炎癥的功能,也具有抵抗炎癥的作用。當H1N1病毒通過呼吸道傳播進入肺組織后,刺激宿主調動巨噬細胞活化免疫系統,使IL-6分泌增加,IL-6可通過募集單核細胞至抗原感染部位,誘導炎癥細胞黏附、聚集,抑制Treg細胞分化及抑制T細胞凋亡,導致肺血管的通透性増加,引起肺間質水腫,發揮促炎作用。在腸道組織中,IL-6可通過信號轉導,激活轉錄激活因子3(STAT3),促進上皮細胞增殖,抑制其凋亡,從而達到抗炎效果。Cao等[12]研究發現與正常小鼠相比,IL-6-/-小鼠促進了葡聚糖磷酸鈉鹽誘導的結腸炎的發生。Ye等[13]發現,與IL-10缺陷小鼠相比,IL-6與IL-10雙重缺陷的小鼠可通過抑制Treg/CTLA-4、促進IL-1β/Th2通路顯著加重了腸道炎癥,展現出更早的疾病發作,且會誘導全身炎癥。同時,也有一些腸炎模型中,IL-6表現出升高的趨勢[14-16]。因此,IL-6在腸道炎癥中的作用存在較大爭議,是我們今后研究的重點。

與IL-6類似,IL-33參與多種自身免疫性疾病的發生和進展,但其在不同自身免疫性疾病中的作用和機制不盡相同(甚至各異),提示其作用的多樣性。例如:通過誘導Th2免疫應答而緩解Th1/Th17介導的EAE[17];通過作用于肥大細胞,可促進Th1/Th17免疫應答來參與類風濕關節炎發生[18]。段利華等[19]的研究發現,體外給予小鼠IL-33可緩解TNBS誘導的腸炎,其機制可能與上調Treg相關。因此,與正常對照組相比,本研究模型組小鼠腸組織中IL-33顯著性降低是正常情況,但其具體機制有待于進一步研究。

綜上所述,甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎-腸炎模型造模成功,最佳感染劑量為1 TCID50,該造模方法穩定、可靠,胃腸型流感的病理基礎及抗病毒藥物研究提供工具和手段。