缺氧誘導因子1α對小膠質細胞M1極化的影響及其機制研究

張雪兒安紅偉

(廣西中醫藥大學第三附屬醫院神經內科,廣西 柳州 545000)

缺血性卒中(ischemic stroke)是指腦缺血缺氧導致腦組織損傷,進而產生神經功能缺損的一類疾病,其主要原因為腦供血動脈狹窄或閉塞。缺血性卒中是全球致死和殘疾的第二大原因[1]。小膠質細胞(microglial)作為大腦的巨噬細胞,可以監測微環境并啟動免疫應答。在對各種腦損傷的反應中,小膠質細胞被激活并極化為M1型小膠質細胞(促炎)或M2型小膠質細胞(抗炎)[2]。這些小膠質細胞所產生的免疫調節分子如各種炎性因子和趨化因子分別與缺血性腦卒中后的繼發性腦損傷或腦修復密切相關;近年來,許多研究發現在腦灌注不足的動物模型中發現小膠質細胞細胞數量顯著增加,且小膠質細胞M1極化產生的炎癥免疫反應與缺血性腦卒中息息相關[2-4]。轉錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription1,STAT1)、核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是小膠質細胞M1極化相關通路中的關鍵因子[1]。近期研究發現在機體缺血缺氧狀態下,HIF-1α表達升高,小膠質細胞活化明顯[5]。因此,研究推測HIF-1α參與小膠質細胞活化極化過程。本研究用不同濃度的重組HIF-1α蛋白處理體外培養的小膠質細胞,觀察HIF-1α對小膠質細胞形態的影響以及對小膠質細胞p-STAT1、NF-κB p65和TRAF6蛋白的表達影響,以期明確HIF-1α是否參與小膠質細胞M1極化過程以及其參與機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

小鼠小膠質細胞—BV-2細胞系(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養基(gibco,貨號:C11330500BT);南美胎牛血清(gibao,貨號:10270106);雙抗(gibco,貨號:15140122);重組HIF-1α蛋白(prospec,貨號:PRO-477);蛋白marker(thermo,貨號:26616);iba1抗體(novus biologicals,貨號:NB100-1028);猴抗羊IgG-FITC(proteintech,貨號:SA00003-3);DAPI(abcam,貨號:ab104139);GAPDH(CST,貨號:D16H11);NF-κB p65(bioss,貨號:BSM-33059M);p-STAT1(santa,貨號:sc-8394);TRAF6(santa,貨號:sc-8409);羊抗兔IgG(bioss,貨號:bs-0295G);羊 抗 鼠IgG(bioss,貨 號:bs-40296G);10%山羊血清(beyotime,貨號:C0265);BSA(biofroxx,貨號:4240GR100);meilunbio飛克特超敏ECL發光液(meilunbio,貨號:MA0186);抗體稀釋液(beyotime,貨號:WB100D)。

共聚焦顯微鏡(nikon);化學發光儀(BLT);酶標儀(thermo);電泳槽(晟利科技,貨號:seli-1-0248);電泳儀(bio-rad);電轉芯(easybio,貨號:BE6092);CO2培養箱(biobase)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

采用DMEM/F12培養基、胎牛血清和雙抗培養BV-2小膠質細胞,置于5% CO2、37℃培養箱培養并傳代。取對數生長期細胞,接種于24孔板(細胞爬片提前置于24孔板內)和6孔板,加培養基培養1 d后隨機分為6組:Control組、10、50、100、200和500 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組,每組設3個副孔。Control組不作處理;重組HIF-1α蛋白處理組分別用重組HIF-1α蛋白10、50、100、200和500 μg/L處理BV-2細胞24 h。

1.3.2 iba1熒光共聚焦

吸凈二十四孔板里的培養基,PBS洗1遍;用4%多聚甲醛將二十四孔板里的細胞爬片固定15 min,PBS洗3遍;用0.5% Triton通透細胞爬片10 min,洗3遍;扣出細胞爬片放入濕盒,用10%山羊血清室溫保濕封閉1 h;往每張爬片上滴加Iba1抗體(1∶500,羊抗)4℃保濕孵育過夜。次日洗3遍后,滴加猴抗羊IgG-FITC(1∶100),室溫保濕避光孵育1 h,洗3遍,DAPI避光復染后,共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 蛋白免疫印跡

按照上述分組處理細胞后,收集各組細胞,采用BCA法對各組蛋白進行定量,計算上樣量。取樣進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉法電轉移至PVDF膜,據需要的目的蛋白分子量切取條帶,BSA封閉2 h,放入稀釋好的GAPDH(1∶1000,兔抗)、NF-κB p65(1∶1000,兔單克隆抗體)、p-STAT1(1∶200,鼠單克隆抗體)和TRAF6(1∶200,鼠單克隆抗體),4℃孵育過夜,后放置于羊抗兔IgG(1∶5000)、羊抗鼠IgG(1∶5000),4℃孵育2 h,加入發光液,放入儀器成像。采用Image J軟件測量條帶灰度值并進行分析。

1.4 統計學方法

數據采用Graphpad Prism 9.2進行統計分析,計量資料采用平均數±標準差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用單因素方差分析(One-ANOVA),P＜0.05表示差異具有統計學意義,所有實驗均重復3次以上。

2 結果

2.1 重組HIF-1α蛋白對小膠質細胞形態的影響

Control組可觀察到BV-2細胞突起較多,呈細長狀,且胞體較為扁平(圖1A箭頭);與Control相比,10、50 μg/L重組HIF-1α蛋白處理組BV-2變化相對不明顯,僅為突起稍變短(圖1B、1C箭頭);然而,與Control組相比,100、200、500 μg/L HIF-1α重組蛋白組BV-2細胞可觀察到突起變少變粗短,胞體變圓變鈍(圖1D、1E箭頭),尤其500 μg/L組BV-2細胞類似于巨噬細胞,胞體相對更為圓鈍(圖1F箭頭)。

2.2 蛋白免疫印跡檢測結果

重組HIF-1α蛋白刺激前后的細胞NF-κB p65和TRAF6蛋白表達具有統計學差異(P＜0.05),p-STAT1蛋白表達不具有統計學差異(P＞0.05)。Control組NF-κB p65和TRAF6蛋白表達量很少,經HIF-1α重組蛋白刺激后,不同濃度組NF-κB p65和TRAF6蛋白表達量升高(圖2)。給予重組HIF-1α蛋白刺激后,與Control組相比,50 μg/L濃度以上各組NF-κB p65表達均明顯上升,100 μg/L濃度以上各組TRAF6表達均明顯升高,且NF-κB p65和TRAF6蛋白表達在刺激濃度不同的組間也有明顯差異(圖3,P＜0.05);然而不同濃度組p-STAT1蛋白與Control相比含量均無統計學意義(圖3,P＞0.05)。

圖2 蛋白免疫印跡檢測BV-2細胞NF-κB p65、p-STAT1 and TRAF6表達Figure 2 Expressions of NF-κB p65, p-STAT1 and TRAF6 in BV-2 cells were investigated by Western blot

3 討論

缺血性腦卒中一直是老年人病死及致殘的一大原因,對社會及個人均產生較大的負擔。M1型小膠已被證實可分泌促炎細胞因子,使機體保持促炎狀態,進而促進缺血性腦卒中后腦損傷的發生[6]。研究表明在缺血性卒中發生后,M1型小膠質細胞被活化,從而發揮有害作用。梗死模型小鼠中發現,小膠質細胞數量顯著增加,小膠質細胞趨于M1型極化,其產生的趨化因子可將CD8+的殺傷T細胞招募到缺血腦組織,被認為是加重腦梗死的主要因素[7],而其分泌炎性因子可增加缺血性卒中后內皮壞死和血腦屏障滲漏,進一步促進神經炎癥和腦水腫,最終導致預后不良[8]。因此,本研究從M1型小膠質細胞極化的影響因素及其機制進行探討,為探索治療缺血性卒中新方向奠定基礎。研究表明當機體缺氧時,體內HIF-1α上升,大腦內小膠質細胞活化且炎性介質表達增高,當抑制NF-κB的活化,HIF-1α的產生減少[9],此外,在癲癇小鼠體中,HIF-1α表達增加可導致小膠質細胞數量增加,并誘導其極化至M1型,從而觸發促炎介質的釋放[10],且當下調HIF-1α表達及其參與通路可減少小膠質細胞M1型極化,從而減弱機體炎癥反應[11]。雖然上述過往及最新研究均表明HIF-1α可能與小膠質細胞M1型極化相關,但是HIF-1α是否能直接作用于小膠質細胞進而引起其M1極化并不明確,因此,本研究采用體外實驗證明HIF-1α對小膠質細胞的作用。本研究采用重組HIF-1α蛋白胞外直接刺激小膠質細胞,用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察小膠質細胞的形態,發現小膠質細胞形態偏向M1型極化,說明HIF-1α可能促使小膠質細胞發生M1型極化。目前國內外關于HIF-1α對小膠質細胞M1型極化的作用機制并不明確。過往研究表明當機體缺血/缺氧時,NF-κB在小膠質細胞內被激活,從而促使小膠質細胞釋放促炎細胞因子,如IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等,最終導致繼發性腦功能受損;轉錄因子NF-κB被證實可以激活小膠質細胞,并將這些激活的細胞轉化為M1表型,黃芩素通過減少NF-κB p65的核轉位抑制NFκB信號轉導,抑制小膠質細胞M1極化,從而減少促炎因子IL-6、IL-18和TNF-α的釋放[12],此外,抑制激活的NF-κB上調可減少HIF-1α的產生,從而減弱缺血性卒中后產生的一系列的腦神經免疫炎癥反應[13]。本研究聚焦于NF-κB p65蛋白,發現經過重組HIF-1α蛋白刺激后,NF-κB p65表達量明顯上升(圖3),說明NF-κB p65參與小膠質細胞M1型極化過程。既往研究發現小膠質細胞M1極化涉及的通路包括酪氨酸激酶(janus kinase,JAK)/STAT1/NF-κB通 路、JAK2/STAT3/NF-κB通 路 和Toll樣受體(toll-like receptor-4,TLR4)/髓樣分化蛋白抗原(myeloid differential protein-88,myd88)/NFκB通路[1],具體見圖4。在缺氧狀態時,發現激活的BV-2細胞中p-STAT1水平顯著升高,同時M1小膠質細胞標記物白細胞分化簇(cluster of differentiation,CD68)表達水平升高[14]。Luo 等[15]和Zhou等[16]發現TLR4是小膠質細胞M1極化可能的細胞因子受體,而TRAF6是TLR4/Myd88通路中的關鍵因子,TRAF6可能與小膠質M1極化有關。為了驗證p-STAT1和TRAF6對小膠質細胞M1極化的影響,本研究檢測了p-STAT1和TRAF6蛋白表達量,發現TRAF6在重組HIF-1α蛋白刺激后表達顯著升高,而p-STAT1表達沒有顯著變化(圖3),說明TRAF6和NF-κB p65參與小膠質細胞M1極化過程,我們推測HIF-1α可能通過TLR4/Myd88/NF-κB通路引起小膠質細胞發生M1型極化,p-STAT1經HIF-1α刺激后無顯著差異,這可能是因為它主要經過其他通路使小膠質細胞發生M1型極化,也可能是因為磷酸化的位點本次實驗采用的位點,可以增加其他磷酸化位點的p-STAT1進行再一次驗證。然而有意思的是NF-κB p65在HIF-1α濃度為50 μg/L以上才有明顯升高,而TRAF6需要HIF-1α濃度達到100 μg/L以上才有明顯提高,關于兩個蛋白HIF-1α刺激閾濃度的不同有待進一步研究;但值得肯定的是兩者在HIF-1α為10 μg/L時均不出現明顯變化(圖3),且從共聚焦的圖片來看,HIF-1α的刺激濃度超過50 μg/L才會開始使小膠質細胞M1極化(圖1),這些結果說明需要達到一定的濃度HIF-1α才能使小膠質細胞發生M1型極化。本研究初步探索了HIF-1α對小膠質細胞M1極化的可能機制。然而,HIF-1α對小膠質細胞M1極化是否存在其他的共同作用機制尚不完全清楚,需要進一步的體外和體內研究來證實。

圖4 小膠質細胞M1極化的機制圖[1]Figure 4 Mechanistic diagram of M1 polarization in microglia

注:A:對照組;B:10 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;C:50 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;D:100 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;E:200 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;F:500 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組。與對照組相比, *P＜0.05, **P＜0.1, ***P＜0.01;與200、500 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組相比, #P＜0.05;與500 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組相比, ##P＜0.01。圖3 缺氧誘導因子1α對NF-κB p65、p-STAT1和TRAF6蛋白表達量的影響Note.A, Control group.B, 10 μg/L HIF-1α treatment group.C, 50 μg/L HIF-1α treatment group.D, 100 μg/L HIF-1α treatment group.E, 200 μg/L HIF-1α treatment group.F, 500 μg/L HIF-1α treatment group.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.1, ***P＜0.01.Compared with 200 and 500 μg/L HIF-1α treatment group, #P＜0.05.Compared with 500 μg/L HIF-1α treatment group, ##P＜0.01.Figure 3 Effects of HIF-1α on the expression of NF-κB p65, p-STAT1 and TRAF6 proteins

注:A:對照組;B:10 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;C:50 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;D:100 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;E:200 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組;F:500 μg/L缺氧誘導因子1α重組蛋白刺激組。圖1 缺氧誘導因子1α誘導小膠質細胞M1極化Note.A, Control group.B,10 μg/L HIF-1α treatment group.C, 50 μg/L HIF-1α treatment group.D, 100 μg/L HIF-1α treatment group.E, 200 μg/L HIF-1α treatment group.F, 500 μg/L HIF-1α treatment group.Figure 1 HIF-1α induced polarization of M1 in microglia

綜上,本研究發現HIF-1α可誘導小膠質細胞M1型極化,其作用機制可能通過上調TLR4/Myd88/NF-κB通路來實現的。