miR-214對異丙酚麻醉大鼠術后神經元損傷的保護作用

楊繼梅盧文江周嬌潔

(樂山市人民醫(yī)院麻醉科,四川 樂山 614000)

每年數(shù)以百萬計的嬰兒或兒童在外科手術診斷中接受麻醉劑。然而,麻醉劑會導致包括靈長類和嚙齒動物在內的哺乳動物大腦發(fā)育中普遍出現(xiàn)神經退行性變[1]。異丙酚是一種常用于嬰兒或兒童全身麻醉藥物,盡管其具有短效的優(yōu)點,但已被證實具有神經毒性,主要導致發(fā)育中大腦的神經元死亡[2-3]。因此,進一步了解異丙酚神經毒性的潛在機制,尋找靶向治療方法以消除異丙酚等麻醉藥的副作用具有重要意義。microRNAs(miRs)是一類短的非編碼RNA分子,可以與mRNAs中的多個序列結合,進一步下調靶基因,其調控作用解除可能導致神經系統(tǒng)疾病[4]。大約70%的已知miRs在大腦中特異表達或富集,并在神經系統(tǒng)的功能和發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用[5]。前期研究支持異丙酚誘導的miRs影響嚙齒類動物發(fā)育中海馬星形膠質細胞的凋亡[6]。此外,miR-223-3p/TIAL1相互作用參與了體外右美托咪定對海馬神經元細胞的保護作用[7]。因此,我們推測異丙酚可能通過miRs對神經元損傷有一定調節(jié)作用。已經發(fā)現(xiàn)miR-214具有神經保護作用,其上調減輕了異氟醚誘導的神經元細胞的死亡脆弱性[8]。此外,miR-214的表觀遺傳減少上調星形膠質細胞集落刺激因子-1,并參與神經損傷引起的神經病理性疼痛[9]。異丙酚對發(fā)育中大腦的神經毒性影響尚不完全清楚。在本研究中,我們假設miR-214上調可以抑制異丙酚麻醉開腹探查誘導的神經元損傷,并試圖探索miR-214對神經元損傷保護作用的潛在生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體動物(specific pathngen free animal,SPF)7日齡(P7)SD雄性大鼠(體重10～15 g)60只,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],喂養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心[SYXK(渝)2018-0003],給予充足飼料和自由飲水,環(huán)境溫度(22±1)℃,濕度50%左右,控制光照時間7:00～19:00。動物實驗經樂山市人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準(KLLY-2019-023),并嚴格遵循實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗鼠Akt購自美國Abcam公司;mTORC1、TEFB、C-caspase3和GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;FITC/TRITC共軛二級抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;4’6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI),青霉素和鏈霉素,脂質體2000轉染試劑購自美國Sigma公司;原位細胞死亡檢測試劑盒購自美國Roche公司;TRIzol一步法購自美國Invitrogen公司;GoTaq qPCR Master Mix購自美國Promega公司;DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;HT22海馬神經元細胞購自江蘇Bena Culture Collection公司;miR-214抑制劑和mTORC1抑制劑均購自上海吉瑪制藥技術有限公司;雙氰胺酸蛋白質測定法購自上海Biotype公司;增強化學發(fā)光試劑(ECL)購自美國Pierce公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

H-500透射電鏡購自日本Olympus Optical公司;ECLIPSE Ti顯微鏡購自日本Nikon公司;ABI7900HT實時PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司;FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將動物隨機分為4組(每組15只):生理鹽水組(NS),異丙酚麻醉開腹探查組(Model),異丙酚麻醉開腹探查+miR-NC-agomir組(miR-NC),異丙酚麻醉開腹探查+miR-214-agomir組(miR-214)。除NS組外,其余組腹腔注射50 mg/kg異丙酚,待翻正反射恢復(40～60 min)后,再注射50 mg/kg的異丙酚,維持麻醉2 h。麻醉中,大鼠取仰臥位,常規(guī)消毒后,上腹部切口3 cm,開胸后依次探查肝、胃、胰、脾、腎,探查時間15 min,整個手術1 h。miR-NC組和miR-214組在異丙酚麻醉前48 h將miR-NCagomir或miR-214-agomir(20 nmol/L,廣州銳博生物技術有限公司)注射到海馬內。各組大鼠清醒2 h后取海馬進行后續(xù)實驗,每組5只進行透射電鏡觀察,5只進行免疫組化和末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色,5只用于RNA提取。

1.3.2 透射電鏡

大鼠用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,然后分別用生理鹽水、2%多聚甲醛和2.5%戊二醛灌注。隨后,切斷大鼠的大腦,分離海馬,將海馬的CA1區(qū)組織(1 mm3)在4℃用2.5%戊二醛固定2 h,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,用鋨酸固定,用乙醇和丙酮脫水,用Epon618環(huán)氧樹脂和100%丙酮浸泡,最后在36℃～60℃聚合,制備50 nm超薄切片。切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色,然后用H-500透射電鏡觀察海馬神經元的超微結構。

1.3.3 免疫熒光

免疫熒光法檢測海馬mTORC1的表達[7]。大鼠用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,然后分別用生理鹽水、2%多聚甲醛心內灌注,石蠟包埋切片進行免疫熒光。石蠟切片用0.2% Tritonx-100脫蠟滲透。然后將切片室溫下與10%正常山羊血清孵育30 min,以阻斷非特異性結合,然后在4℃下與兔抗鼠Akt(1∶1000)、mTORC1(1∶800)孵 育 過 夜,并 與FITC/TRITC共軛二級抗體(1∶100)在室溫下孵育3 h。核染色用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(500 ng/mL)處理5 min,沖洗后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 TUNEL分析

使用原位細胞死亡檢測試劑盒檢測海馬組織細胞凋亡[8]。對腦海馬切片進行脫蠟和再水化處理20 min后,PBS沖洗3次。在暗處加入TUNEL反應混合物(TdT:核酸混合物=1∶9),37℃下孵育1 h。在室溫下用DAPI處理切片7 min。圖像通過ECLIPSE Ti顯微鏡獲得,并通過Image J軟件進行分析。在海馬CA1區(qū)隨機選取5個區(qū)域,計算每個切片的TUNEL陽性細胞數(shù)。凋亡指數(shù)以凋亡細胞總數(shù)占細胞總數(shù)的比例計算。

1.3.5 實時定量PCR(RT-qPCR)分析

用TRIzol一步法提取海馬組織總RNA,并在0.2 mL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的PCR管中加入5 μg樣品RNA、1 μg隨機引物和DEPC-ddH2O至20 μL,70℃變 性5 min,合 成cDNA[7]。在ABI7900HT實時PCR系統(tǒng)上使用GoTaq qPCR Master Mix進行RT-qPCR,反應條件為:95℃預變性15 min,95℃ 40次變性20 s,60℃退火34 s,2-ΔΔCt法檢測miR-214的表達。所有引物均由上海生工生物科技有限公司設計。用于qPCR的引物序列如下:miR-214正 向:5’-TGCGCTGGCAGTGTCTTTAGC-3’;反向:5’-CCAGTGGGTCCGAGGTA-3’;U6正向:5’-CTCGCTT CGGCAGCACA-3’;反向:5’-GTGTCGTGGAGTCGG CAA-3’。

1.3.6 細胞培養(yǎng)與治療

HT22海馬神經元細胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)[7]。為確定異丙酚的神經毒性,將細胞暴露于不同濃度(0、20、40、60、80和100 μmol/L)異丙酚中孵育。為考察miR-214介導mTORC1在異丙酚刺激HT22海馬神經元細胞中的保護作用,將細胞分為:si-NC+異丙酚組(si-NC+propofol)、simTORC1+異 丙 酚 組(si-mTORC1+propofol)、simTORC1+異丙酚+anti-NC組(si-mTORC1+propofol+si-NC)和si-mTORC1+異丙酚+anti-miR-214組(simTORC1+propofol+ anti-miR-214)。

1.3.7 細胞轉染

HT22海馬神經元細胞,以5×104個/孔接種于24孔板。然后用脂質體2000轉染試劑,分別將miR-214抑 制 劑(anti-miR-214,50 nmol/L)和mTORC1抑制劑(si-mTORC1,20 nmol/L)轉染入細胞。加入miR-NC或空慢病毒載體作為對照。轉染48 h后,收集細胞并將細胞暴露于60 μmol/L異丙酚中孵育24 h,進行以下測定。

1.3.8 蛋白質印跡分析

分析所有實驗組的蛋白質水平變化。處理后,提取蛋白質,并使用雙氰胺酸蛋白質測定法測定。將等量的蛋白質裝載到12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,電泳分離后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用含有0.1%吐溫-20(TBST)的TBS中的5%脫脂乳封閉膜2 h,然后將mTORC1抗體(1∶1000)、TEFB抗 體(1∶800)、C-caspase3(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)第一抗體與膜在4℃孵育過夜。用TBST清洗膜3次,再用二級抗體(1∶5000)在室溫下孵育30 min。最后用增強化學發(fā)光試劑(ECL)觀察免疫反應信號。

1.3.9 流式細胞術分析

使用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡試劑盒處理細胞,然后通過FACSCalibur流式細胞儀分析凋亡細胞。每個實驗分別進行3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示。各組間的差異采用t檢驗進行評估,多組間的差異采用單因素方差分析進行比較。重復測量資料采用重復測量的方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-214在異丙酚麻醉開腹探查模型和細胞模型中表達失調

為了證實異丙酚麻醉開腹探查模型中miR-214的失調,我們首先用RT-qPCR分析了NS組和模型組大鼠中miR-214的水平。結果發(fā)現(xiàn),與NS組相比,模型組大鼠海馬中miR-214明顯下調(P＜0.01)。此外,與miR-NC組相比,miR-214組大鼠海馬中miR-214明顯增加(P＜0.001)(圖1A)。研究進一步使用異丙酚治療HT22海馬神經元細胞。在該模型中,由異丙酚誘導的miR-214失調與動物模型的結果一致,并且由異丙酚以劑量依賴性(0～100 μmol/L,24 h)和時間依賴性(60 μmol/L,0～36 h)的方式降低miR-214水平(圖1B、1C)。

2.2 miR-214減輕異丙酚麻醉開腹探查誘導的神經細胞凋亡

采用透射電鏡和TUNEL觀察神經細胞凋亡情況。結果表明,與NS組比,模型組誘導海馬神經細胞凋亡(P＜0.001),電鏡下可見神經元腫脹、核碎裂。此外,染色質密度降低,凋亡小體出現(xiàn),突觸間隙變寬,突觸后密度變薄。與模型組比,miR-214組電鏡下顯示神經元細胞和突觸縫隙的變化很細微,并且海馬神經元凋亡減弱(P＜0.01)(圖2、圖3)。

圖2 各組透射電鏡掃描的典型圖像Figure 2 Typical images scanned by transmission electron microscopes in each group

2.3 miR-214與mTORC1結合

為了進一步研究miR-214影響異丙酚麻醉開腹探查誘導的神經細胞凋亡的分子機制,研究使用了一些在線靶點預測工具,包括miRDB、miRanda和TargetScan,結果獲得了6個候選靶基因(圖4A)。其中,mTORC1已被證實參與神經元凋亡[9],被選擇用于隨后的實驗(圖4B)。在mTORC1的3’UTR和miR-214的種子序列之間觀察到高度保守的配對(圖4C)。接下來,我們用熒光素酶報告分析法精確評估了miR-214抑制mTORC1的能力。正如預期的那樣,用miR-214模擬物轉染阻止了野生型熒光素酶表達,而突變體未觀察到這些作用(圖4D)。此外,通過免疫熒光檢測異丙酚麻醉開腹探查模型中mTORC1表達,與NS組比較,模型組誘導海馬神經組織中mTORC1表達增加(P＜0.05),miR-214治療顯著降低了mTORC1表達(P＜0.05)(圖5)。這些結果表明mTORC1是miR-214的直接靶基因。

注:A:大鼠海馬組織中miR-214的表達;與NS組相比, **P＜0.01;與miR-NC組相比, ###P＜0.001;B:不同濃度異丙酚刺激下HT22細胞中miR-214的表達;與0 μmol/L組相比, *P＜0.05, **P＜0.01;C:異丙酚不同刺激時間下HT22細胞中miR-214的表達;與0 h組相比, **P＜0.01。圖1 miR-214在異丙酚麻醉開腹探查模型和細胞模型中表達失調Note.A, Expression of miR-214 in rat hippocampus.Compared with NS group, **P＜0.01.Compared with miR-NC group, ###P＜0.001.B, Expression of miR-214 in HT22 cells stimulated by different concentrations of propofol.Compared with 0 μmol/L group, *P＜0.05, **P＜0.01.C, The miR-214 expression in HT22 cells under different stimulation times of propofol.Compared with 0 h group, **P＜0.01.Figure 1 miR-214 was dysregulated in a propofol-anaesthetized laparotomy model and a cellular model

2.4 miR-214介導mTORC1在異丙酚刺激HT22海馬神經元細胞中的保護作用

流式細胞術分析顯示,si-mTORC1轉染的暴露于異丙酚的HT22海馬神經元細胞的凋亡率顯著低于NC對照組,而miR-214抑制劑轉染顯著逆轉了si-mTORC1的保護作用(圖6)。Western blot結果顯示,si-mTORC1轉染的暴露于異丙酚的HT22海馬神經元細胞中mTORC1表達水平明顯降低(P＜0.05),表明si-mTORC1轉染的效率很高。與NC對照相比,si-mTORC1轉染導致暴露于異丙酚的HT22海馬神經元細胞中TFEB表達顯著增加(P＜0.01),以及C-caspase3降低(P＜0.05)。而miR-214抑制劑轉染顯著逆轉了si-mTORC1誘導的mTORC1、TFEB、C-caspase3蛋白表達的變化(P＜0.05)(圖7、8)。

3 討論

已經證實,早期暴露于異丙酚可能與長期學習和記憶損傷相關,并導致發(fā)育中大腦中廣泛的神經元凋亡[10]。miRs已被證實參與神經系統(tǒng)疾病的病理過程[5]。因此,在本研究中,我們試圖探討miR-214在異丙酚神經毒性中的潛在生物學機制以及可能的分子因素。我們發(fā)現(xiàn)miR-214在異丙酚麻醉開腹探查模型和細胞模型中表達失調。重要的是,miR-214可以改善海馬神經元凋亡。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明miR-214在調節(jié)異丙酚麻醉開腹探查誘導的海馬神經元損傷中的重要作用。

越來越多的證據(jù)表明,miRNAs在調節(jié)麻醉劑誘導的神經細胞死亡或神經毒性方面起著重要作用[11]。例如,研究發(fā)現(xiàn)miR-132[12]在調節(jié)布比卡因誘導的神經毒性中起重要作用。此外,氯胺酮上調海馬miR-34a表達,慢病毒抑制miR-34a通過成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)保護氯胺酮誘導的海馬細胞凋亡和記憶損傷[13]。氯胺酮誘導的miR-375上調和慢病毒介導的miR-375下調通過上調人腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)改善了氯胺酮誘導的神經細胞死亡和人類胚胎干細胞源性神經元的神經毒性[14]。在目前的研究中,我們證明在異丙酚麻醉開腹探查模型中,大鼠海馬中miR-214明顯下調,并且在使用異丙酚治療的HT22海馬神經元細胞中,由異丙酚誘導的miR-214失調與動物模型的結果一致。異丙酚麻醉開腹探查模型和細胞模型中表達失調,這與前期研究一致[8]。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn),異氟醚通過抑制miR-214的表達增加了神經元細胞的死亡,而miR-214過表達顯著抑制異氟醚誘導的SH-SY5Y細胞活力降低、LDH釋放、凋亡和氧化應激,提示miR-214對異氟醚誘導的SH-SY5Y細胞神經毒性具有神經保護作用。此外,前期研究表明,miR-214通過抑制激活轉錄因子4和zeste 2多梳抑制復合物2亞單位增強子的表達來保護紅細胞免受氧化應激[15]。Yang等[16]報道,miR-214通過激活雷帕霉素(mTOR)途徑的Akt/哺乳動物靶點,在糖尿病腎病中對氧化應激具有保護作用。因此,上述結果證實miR-214下調與異丙酚引起的神經毒性有關。

注:綠色染色表示TUNEL陽性細胞,藍色染色表示細胞核。與NS組相比, ***P＜0.001;與Model組相比, ##P＜0.01。圖3 各組海馬TUNEL染色的典型圖像及定量分析Note.Green staining indicates TUNEL positive cells, blue staining indicates cell nuclei.Compared with NS group, ***P＜0.001.Compared with Model group, ##P＜0.01.Figure 3 Typical images of hippocampus stained with TUNEL and quantitative analysis

注:A:利用miRDB、miRanda和TargetScan三種在線預測工具預測miR-214的靶基因;B:潛在靶基因的相對mRNA水平;C:miR-214和mTORC1之間的靶區(qū);D:用miR-NC或miR-214模擬物轉染HT22細胞,檢測mTORC1 3’UTR熒光素酶活性。與miR-NC轉染組比較, **P＜0.01, ***P＜0.001。圖4 miR-214與mTORC1結合Note.A, miRDB, miRanda and TargetScan were used to predict the target gene of miR-214.B, The relative mRNA levels of potential target genes.C, The target area between miR-214 and mTORC1.D, Transfection of HT22 cells with miR-NC or miR-214 mimics to detect mTORC1 3’UTR luciferase activity.Compared with miR-NC group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 4 miR-214 binds to mTORC1

注:紅色染色分別表示mTORC1蛋白,藍色染色表示細胞核。與NS組相比, *P＜0.05;與Model組相比, ##P＜0.01。圖5 mTORC1表達的免疫熒光圖及定量分析Note.Red staining indicates mTORC1 protein, and blue staining indicates cell nucleus.Compared with NS group, *P＜0.05.Compared with Model group, ##P＜0.01.Figure 5 Immunofluorescence of mTORC1 expression and quantitative analysis

注:與si-NC+異丙酚組相比, **P＜0.01;與si-mTORC1+異丙酚+si-NC組相比, ##P＜0.01。圖6 流式細胞術分析HT22海馬神經元細胞凋亡Note.Compared with si-NC+propofol group, **P＜0.01.Compared with si-mTORC1+propofol+si-NC group, ##P＜0.01.Figure 6 Flow cytometry analysis of apoptosis in HT22 hippocampal neurons

注:與si-NC+異丙酚組相比, **P＜0.01, ***P＜0.001。圖7 Western blot分析si-mTORC1對暴露于異丙酚的HT22海馬神經元細胞中mTORC1、TEFB、C-caspase3蛋白表達影響及定量分析Note.Compared with si-NC+propofol group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 7 Effect of si-mTORC1 on the expression of mTORC1, TEFB, C-caspase3 proteins in HT22 hippocampal neurons exposed to propofol was analyzed by Western blot

注:與si-mTORC1+異丙酚+si-NC組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖8 HT22海馬神經元細胞中mTORC1、TEFB、C-caspase3蛋白表達。Note.Compared with si-mTORC1+propofol+si-NC group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 8 Expression of mTORC1, TEFB, C-caspase3 proteins in HT22 hippocampal neurons

眾所周知,miRNAs通過下調靶基因來發(fā)揮其生物學功能。為了進一步了解miR-214作用于異丙酚引起的神經毒性的機制,我們使用了幾種在線預測工具,如TargetScan、miRDB和miRanda,確定了雷帕霉素復合物1(mTORC1)為miR-214的新靶點,熒光素酶報告分析進一步證實了這種靶點。mTORC1是mTOR蛋白超家族的一員,其在協(xié)調能量、生長信號與細胞生長、分裂中發(fā)揮重要作用,并對多種脅迫作出反應。mTORC1信號通路的失調導致癌癥、代謝疾病和糖尿病[17]。最近研究發(fā)現(xiàn),mTORC1過表達抑制缺血再灌注損傷神經元自噬相關mRNA翻譯,誘導神經元損傷[18]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),慢性mTORC1抑制可挽救小鼠因神經元Depdc5丟失導致的行為和生化缺陷[19]。故本研究選擇mTORC1作為miR-214調控異丙酚引起的神經細胞凋亡中的靶標,結果顯示,miR-214治療顯著降低了異丙酚麻醉開腹探查大鼠海馬中mTORC1表達。此外,si-mTORC1轉染對暴露于異丙酚的HT22海馬神經元細胞存活具有有利影響。研究還發(fā)現(xiàn)miR-214抑制劑消除了si-mTORC1對異丙酚誘導的HT22海馬神經元細胞的保護作用。因此,mTORC1可能是miR-214的下游效應物。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)si-mTORC1轉染的HT22海馬神經元細胞中TFEB蛋白表達顯著增加。TFEB是轉錄因子的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈轉錄因子家族的一員,其受到mTORC1機制靶點的負調控,這是限制自噬誘導的主要已知因素[20]。mTORC1的抑制導致TFEB的激活;最近發(fā)現(xiàn),TFEB的激活對于阿爾茨海默病和神經退行性疾病的治療均產生有益影響[21]。因此,miR-214可能通過mTORC1-TFEB通路保護異丙酚麻醉開腹探查誘導的神經元損傷。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)異丙酚暴露可導致神經元損傷。miR-214預處理可通過mTORC1-TFEB通路減輕異丙酚神經毒性,提高神經元的存活率。我們的發(fā)現(xiàn)可能為開發(fā)新的預防異丙酚誘導的神經損傷的治療方法和臨床麻醉管理提供新的見解。