紫菀酮改善OVA誘導哮喘SD幼鼠的免疫反應及TLRs的表達

艾 奎李 楨

(武漢市第三醫院光谷院區兒科,武漢 430074)

哮喘是最常見的呼吸道疾病之一,具有較高的發病率和死亡率,我國約有4千萬人患有哮喘[1]。哮喘起病早,多發于嬰幼兒期,小兒哮喘的癥狀主要為咳嗽、胸悶、呼吸困難、反復發作的喘息等,且多發于凌晨和夜間,其病因主要包括遺傳和環境等因素,空氣污染、呼吸道感染、氣候轉變、過敏原、食物等均可誘發哮喘[2-3]。氣道慢性炎癥是哮喘的主要特征,免疫功能紊亂是形成氣道炎癥的基礎,而Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是固有免疫系統的主要組分,已被證實能夠調節并加速氣道炎癥[4-5]。

西醫治療哮喘的傳統藥物主要以糖皮質激素為主,短期內具有良好效果,但長期服用會產生耐藥性和副作用,且停藥后易復發[6]。諸多研究表明中醫藥在治療哮喘上具有明顯優勢,能有效改善哮喘患者的癥狀,降低氣道高反應性[7]。紫菀酮(shionone)是紫菀最主要的有效活性成分,具有抗炎作用,能夠通過抑制炎癥細胞因子的產生來減輕肺部炎癥從而減輕哮喘[8],由此推測紫菀酮作用下TLRs的表達可能也會受到影響。本研究首先構建卵清蛋白(onalbumin,OVA)誘導哮喘幼鼠模型,并用紫菀酮進行干預治療,通過比較紫菀酮干預后TLRs表達量的變化及肺組織的炎癥情況,從而找到紫菀酮治療哮喘時差異表達的TLRs,為后續深入探究紫菀對TLRs先天免疫反應信號通路的作用機制打下基礎,并有望找到新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24只5日齡SPF級雄性SD大鼠,體重為18～22 g,來源于三峽大學[SCXK(鄂)2017-0012],在武漢華聯科生物技術有限公司進行實驗[SYXK(鄂)2018-0104],動物合格證號:No.00288340,設施使用證號:NO.320730208624181627。喂養條件:室溫21℃～25℃,相對濕度50%～70%,喂養過程中幼鼠自行攝食及飲水。實驗過程中遵循了3R原則,經武漢華聯科生物技術有限公司倫理審批委員會批準(HLK-20210801-01)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉、卵清蛋白(美國Sigma公司;貨號:P3761、A5503-50G);氫氧化鋁、地塞米松(中國阿拉丁公司;貨號:A110525-500 g、D137736-1 g);紫菀酮(上海源葉生物科技有限公司;貨號:B21703-20 mg);二甲苯(北京沃凱生物科技有限公司;貨號:40091060);碳酸鋰、冰醋酸、中性樹脂(國藥集團上海有限公司;貨號:20022818、10000218、213);伊紅(中國Solarbio公司;貨號:E8090);蘇木素(上海碧云天生物技術有限公司;貨號:C0107);TRIzol(美國ambion公司;貨號:15596026);SYBR FAST qPCR Master Mix(美國KAPA Biosystems公司;貨號:KM4101);反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司;貨號:2690A);TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-13 ELISA試劑盒(中國Bioswamp公司;貨號:RA20035、RA20020、RA20607、RA20088、RA20034)。

電子天平(舜宇光學科技有限公司;型號:FB124);手術直剪、顯微剪、顯微鑷(上海金鐘手術器械廠;型號:J21070、WA1020、WA3040);正置顯微鏡、石蠟切片機(徠卡顯微系統有限公司;型號:DM1000、RM2235);攤片烤片機、生物組織包埋機(沈陽恒松科技有限公司;型號:TK7218、HS-B型);PCR儀(杭州柏恒科技有限公司;型號:GE48527);熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司;型號:CFXConnect 96);超微量分光光度計、酶標分析儀、酶標洗板機(杭州奧盛儀器有限公司;型號:Nano-300、AMR-100、APW-200)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構建及鑒定

SD幼鼠適應性飼喂3 d后,在1、14 d分別注射200 μL OVA(40 μL OVA+2 mg氫氧化鋁,溶解于200 μL滅菌的PBS中)致敏,第28～31天每天用5% OVA霧化30 min激發哮喘發作,隨后鼻內注射20 μL OVA(40 mg/mL)1次,當幼鼠出現呼吸加快、口唇發鉗、點頭呼吸等哮喘癥狀時表示哮喘模型構建成功。末次霧化、滴鼻激發后觀察30～60 min,依據癥狀(噴嚏、流涕、鼻癢)對幼鼠的行為學癥狀進行打分,采用疊加量化加分的方法,所得總分大于5分即建模成功。行為學癥狀分級評分標準見表1。

表1 SD幼鼠行為學癥狀分級評分標準Table 1 Behavioral symptom grading and scoring standards of young SD rats

1.3.2 實驗分組及取材

將幼鼠隨機分為4組:對照組、模型組、紫菀酮組、地塞米松組,每組6只。對照組幼鼠正常喂養,不作處理;模型組OVA誘導哮喘;紫菀酮組OVA誘導哮喘后紫菀酮按照每日80 mg/kg劑量灌胃治療,連續7 d;地塞米松組OVA誘導哮喘后每天1次霧化吸入10.5 mg/kg劑量的地塞米松,連續7 d。最后1次給藥后2 h,稱體重,麻醉處死,取血分離血清,接著迅速剝離右肺,摘取右肺中葉,置于10%福爾馬林中固定備用,其余肺組織標本放置去酶EP管中,注入RNAlate試劑,立即放入4℃冰箱,24 h后轉入-80℃冰箱凍存備用。

1.3.3 行為學觀察

滴鼻激發后觀察幼鼠哮喘一般體征,記錄飲食、體重、哮喘一般體征包含是否煩躁不安,呼吸是否困難,口鼻是否有粘液等,藥物干預過程中觀察幼鼠呼吸的變化。

1.3.4 HE染色病理學觀察

將固定好的右肺葉取橫切面,石蠟包埋后切片,厚度約為3 μm,水浴展片并及時烤片,按照蘇木精-伊紅染色法的步驟進行組織染色,顯微鏡觀察支氣管粘膜及粘膜下炎癥細胞浸潤及酸性粒細胞的浸潤情況。

1.3.5 qPCR檢測TLRs受體因子(TLR1～TLR10)的表達

TRIzol法提取總RNA,后逆轉錄合成cDNA,進行PCR擴增。擴增體系:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 8 μL。反應程序:95℃預變性3 min,95℃變性5 s,56℃退火10 s,72℃延伸25 s,共40個循環。以GAPDH為內參,2-△△Ct法計算相對表達量。引物序列見表2,PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3.6 ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中細胞因子表達

按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-13的表達水平。

1.4 統計學方法

利用SPSS 25.0和Excel進行統計學分析,數據以平均數±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 模型鑒定及行為學變化

模型組的行為學癥狀為(7.00±0.89)分,表明模型構建成功。

對照組幼鼠呼吸和精神狀態均正常;實驗前期模型組、紫菀酮組和地塞米松組幼鼠均出現呼吸急促,打噴嚏口鼻發紫,有粘液分泌,亢奮易怒的情況;紫菀酮組用藥3 d后呼吸仍急促,口鼻顏色呈紫紅色,4 d后個別幼鼠出現怠惰嗜睡的情況,用藥后期幼鼠粘液分泌減少或消失,呼吸趨于平緩,亢奮易怒的情況也有所減少;地塞米松組用藥后期呼吸較為平緩,仍打噴嚏,但幾乎不抓鼻,還出現攻擊性增強的情況,而紫菀酮組未出現攻擊性增強的現象。整個實驗過程未出現幼鼠死亡,所有實驗正常進行。

2.2 SD幼鼠肺組織病理學變化

HE染色結果如圖1所示。對照組幼鼠的肺泡和支氣管正常,無炎癥細胞;模型組的支氣管粘膜充血水腫,各級支氣管上皮細胞呈現不同程度的脫落,氣道及肺組織周圍有大量炎癥細胞浸潤,主要包括嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等;與模型組相比,紫菀酮組和地塞米松組的支氣管粘膜充血水腫的程度有所緩解,氣道及肺組織周圍炎癥細胞的數量也有所減少。

圖1 SD幼鼠肺組織HE染色結果Figure 1 HE staining results of lung tissue of young SD rats

2.3 各組TLRs受體因子表達水平的比較

結果如表3所示。與對照組相比,模型組TLR1、TLR9、TLR10 mRNA的表達量顯著降低(P＜0.01),TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 mRNA的表達量顯著升高(P＜0.01);與模型組相比,紫菀酮組和地塞米松組TLR1、TLR9、TLR10 mRNA的表達量顯著升高(P＜0.01),TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 mRNA的表達量顯著降低(P＜0.01)。

表3 各組TLRs受體因子表達水平的比較Table 3 Comparison of TLRs receptor factor expression levels in each group

2.4 各組炎性因子表達水平的比較

結果如表4所示。與對照組相比,模型組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-13的水平均顯著升高(P＜0.01);與模型組相比,紫菀酮組和地塞米松組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-13的水平均顯著降低(P＜0.01)。

表4 各組炎性因子表達水平的比較Table 4 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in each group

3 討論

支氣管哮喘是一種由遺傳和環境等因素引發的氣道慢性炎癥性疾病,多種細胞和細胞成分參與其中[9]。目前,世界范圍內有超過3億人患有哮喘,且患病率呈逐年升高的趨勢[10]。哮喘目前仍無法被根治,對人類健康具有嚴重危害,因此進一步研究哮喘的發病機制,對治療哮喘、改善預后以及研制新藥物具有重要意義。本研究用OVA誘導哮喘幼鼠模型,結果顯示行為學評分大于5分,表明模型構建成功。

紫菀具有消痰止咳、抗炎、抗氧化的功效,紫菀酮是提取自紫菀的1種三萜類化合物,是紫菀的主要有效活性成分[8]。研究表明,紫菀酮能夠通過降低誘導型一氧化氮合酶的表達抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路的激活發揮抗炎作用[11]。本研究發現紫菀酮能夠改善哮喘幼鼠肺組織的病理變化,表明紫菀酮對治療哮喘具有一定的作用。

氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的病理基礎,多種炎性細胞和介質參與哮喘的發生和發展[12]。輔助性T淋巴細胞(helper T cell, Th)1/Th2失衡對哮喘的發生發展具有重要影響,能夠促進嗜酸性粒細胞向氣道的遷移和浸潤,促進哮喘炎癥形成[13]。活化的Th2細胞能夠分泌IL-4,IL-4能夠促進免疫球蛋白E的分泌,從而參與哮喘的氣道炎癥[14]。IL-13是Th2型細胞因子,通過促進黏液分泌、提高氣道免疫球蛋白E的水平、促進肺部嗜酸性粒細胞浸潤等介導氣道炎癥[15]。TNF-α能夠活化NF-κB信號通路,介導多種炎性細胞因子在肺組織中大量浸潤,調節哮喘患者的炎癥反應[16]。IL-1β能夠活化Th2細胞促進氣道炎癥部位嗜酸性粒細胞的活化[17]。IL-6是適應性免疫的主要參與者,由先天免疫細胞分泌,能夠誘導Th2效應細胞的擴張[18]。本研究檢測了相關炎癥因子在血清中的水平,結果顯示,紫菀酮能夠降低炎癥因子的水平,表明紫菀酮能夠抑制哮喘中的炎癥反應,與王芳等[11]的研究結果一致。

TLRs是一種模式識別受體,能夠連接先天性免疫和獲得性免疫,機體內各個部位均有分布,在巨噬細胞、中性粒細胞和上皮細胞等多種細胞內均有表達[19]。目前人體中已經鑒定出10種TLR,分別命名為TLR1～TLR10,主要位于細胞膜上,是參與炎癥反應的重要因子,TLRs通過激活巨噬細胞釋放促炎細胞因子,激活周圍細胞產生黏附和趨化因子,最終將炎癥細胞募集到炎癥部位[20-21]。研究表明,TLRs參與哮喘的發生[22]。楊艷等[23]發現敲除TLR4基因能夠減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥,并能糾正Th1/Th2和Th17/Treg的失衡。本研究檢測了TLR1～TLR10的水平,結果顯示,紫菀酮能顯著升高TLR1、TLR9和TLR10的水平,而顯著降低其他TLRs水平,表明紫菀酮通過調節TLRs的水平抑制炎癥反應,控制哮喘的發生和發展,與上述研究結果一致。

綜上所述,紫菀酮能夠調節OVA誘導哮喘SD幼鼠的炎癥反應,并能使TLRs的表達量產生變化,其機制是否與TLRs先天免疫反應信號有關還有待進一步研究。