塞來昔布調節miR-129-5p/HMGB1抑制TNF-α誘導類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞炎癥因子分泌

時 萍陶 野王晨靜李 欣柳艷平曹 玉

(青島大學附屬醫院,山東 青島 266001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病程漫長和致殘率高的自身免疫性疾病,以關節滑膜炎癥、軟骨和骨質破壞為主要病理特征,可導致關節畸形與功能障礙[1]。近年來,因我國老齡化人口增多,RA發病率有明顯升高趨勢,給人們身體健康和生活質量帶來很大威脅[2]。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast like synoviocytes,FLSs)是滑膜炎癥增生導致RA發生的重要細胞,其異常增生可釋放大量致炎因子,引起關節受損[3]。因此,如何有效抑制FLSs炎癥因子的分泌對RA治療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類細胞內重要的基因調控因子,其異常表達與包括RA在內的多種疾病發生發展密切相關。miR-129-5p是miRNAs家族成員,被報道在RA-FLSs中表達下調,且發揮著抑制RA-FLSs增殖和誘導凋亡的作用[4]。研究發現,miR-129-5p可通過靶向調控高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)抑制炎癥反應減輕脊髓損傷[5],而HMGB1在FLSs炎癥因子的分泌過程中發揮著重要的促進作用[6]。由此猜測,miR-129-5p可能通過靶向調控HMGB1介導FLSs炎癥反應。塞來昔布是一種高選擇性環氧合酶(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑和非甾體類抗炎藥,常用來緩解RA臨床癥狀[7],但其抗RA炎癥的作用機制尚不完全清楚。有研究發現,塞來昔布可通過抑制HMGB1表達減輕癲癇發生后的神經炎癥損 傷[8]。那 么,塞 來 昔 布 是 否 通 過 調 控miR-129-5p從而影響HMGB1表達來發揮抗RA的作用?因此,本研究以人RA-FLSs細胞系MH7A為研究對象,采用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導及塞來昔布干預后觀察miR-129-5p和HMGB1表達變化,初步探討miR-129-5p/HMGB1在塞來昔布抗RA中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 細胞

人RA-FLSs細胞系MH7A(批號:201203)購于上海冠導生物工程有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素鏈霉素溶液、TRIzol試劑、總蛋白質提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司(批號:201216、201110、201209、210120、210109、200204);塞來昔布、脂質體2000、人白細胞介素(interleukin,IL)-6酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、人IL-1β ELISA試劑盒、實時熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司(批號:201225、201106、201003、201212、201219、210101);miR-129-5p mimics、miR-129-5p inhibitor、mimics-NC、inhibitor-NC、HMGB1-siRNA、NC-siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。凝膠成像儀Miulab GIS-500(批號:180524)購自北京乾明基因技術有限公司;實時熒光定量PCR儀(批號:200426)購自翌圣生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

使用含100 U/mL青霉素鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養基于5% CO2、37℃恒溫培養箱內常規培養MH7A細胞。

1.3.2 MTT法檢測MH7A細胞活力

將對數生長期的MH7A細胞接種至96孔板上,常規培養貼壁后,每孔加入100 μL終濃度為0、2.5、5、10、20和40 μmol/L塞來昔布,并設3個平行孔;孵育24 h后,每孔加入20 μL MTT溶液(濃度為5 g/L);孵育4 h后,棄培養基并向每孔中加入二甲基亞砜150 μL;搖床震蕩使結晶物充分溶解后,采用酶標儀在波長492 nm處檢測各孔MH7A細胞吸光度值。實驗重復次數為3。

1.3.3 ELISA法檢測MH7A細胞上清液中IL-6和IL-1β水平

實驗分為(1)對照組:不做處理;(2)誘導組:加入20 ng/mL TNF-α 100 μL[9];(3)誘導+(2.5、5和10 μmol/L)塞來昔布組:分別加入2.5、5和10 μmol/L塞來昔布100 μL預處理1 h后再加入20 ng/mL TNF-α100 μL,每組設置3個復孔。將對數生長期的MH7A細胞接種至96孔板上,于培養箱內常規培養;待細胞貼壁后,根據上述分組處理細胞24 h后,收集各組細胞上清液,嚴格按照IL-6和IL-1β ELISA試劑盒說明書檢測MH7A細胞上清液中IL-6和IL-1β水平。實驗重復次數為3。

1.3.4 RT-qPCR檢測MH7A細胞中miR-129-5p表達水平

收集按照1.3.3中實驗分組處理結束后的各組MH7A細胞,按照TRIzol試劑說明書提取MH7A細胞總RNA后,使用紫外分光光度計檢測RNA濃度及完整性;將RNA行逆轉錄合成cDNA后,以此為模板,按照RT-qPCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR擴增;將U6作為內參照,2-△△Ct法計算MH7A細胞中miR-129-5p表達水平。其中,擴增程序:95℃預變性6 min后,轉入38個循環階段95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s。由上海生工生物工程股份有限公司合成的引物序列如下:miR-129-5p 上游5’-GTGCTTATAGTGCAGGTA-3’,下游5’-GAACAT GTCTGCGTATCTC-3’;U6上 游5’-GCTTCGGCAG CACATATACTAAAAT-3’,下游5’-CGCTTCACGAA TTTGCGTGTCAT-3’。實驗重復次數為3。

1.3.5 Western blot檢測MH7A細胞中HMGB1蛋白表達

收集按照1.3.3中實驗分組處理結束后的各組MH7A細胞,根據總蛋白提取試劑盒說明書抽提MH7A細胞總蛋白后,采用二奎啉甲酸法檢測總蛋白濃度;將變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE分離后,轉膜;以5%脫脂奶粉封閉膜1.5 h后,加入稀釋2000倍的HMGB1抗體和GAPDH抗體4℃孵育過夜;次日,加入稀釋5000倍的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h;經化學發光劑顯影曝光后,以GAPDH作為內參照,采用Image J軟件分析MH7A細胞中HMGB1蛋白表達水平。實驗重復次數為3。

1.3.6 細胞轉染

將對數生長期的MH7A細胞接種至6孔細胞板上,常規培養至65%～75%融合度時,參照脂質體說明書進行瞬時轉染;其中,將僅轉染mimics-NC、miR-129-5p mimics、inhibitor-NC、miR-129-5p inhibitor的MH7A細胞分別記為mimics-NC組、miR-129-5p mimics組、inhibitor-NC組、miR-129-5p inhibitor組;將轉染mimics-NC、miR-129-5p mimics、NC-siRNA、HMGB1-siRNA且經20 ng/mL TNF-α處理的MH7A細胞分別記為誘導+mimics-NC組、誘導+miR-129-5p mimics、誘導+NC-siRNA組和誘導+HMGB1-siRNA組;將轉染inhibitor-NC、miR-129-5p inhibitor且經20 ng/mL TNF-α和10 μmol/L塞來昔布處理的MH7A細胞分別記為誘導+藥物+inhibitor-NC組、誘導+藥物+miR-129-5p inhibitor組,每個處理組均設3個復孔。在轉染6 h后更換新鮮培養基,繼續培養48 h后收集各組細胞及上清液,參照上述方法檢測MH7A細胞中miR-129-5p表達、HMGB1蛋白表達及細胞上清液中IL-6和IL-1β水平。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗

采用生物信息學軟件預測到HMGB1 3’UTR與miR-129-5p之間存在互補的結合位點;將HMGB1 3’UTR與miR-129-5p結合位點序列和定點突變后的序列克隆重組至psiCHECK-2載體上,分別構建psiCHECK-2-HMGB1野 生 型(HMGB1-wt)載 體 和psiCHECK-2-HMGB1突變型(HMGB1-mut)載體。參照脂質體2000說明書將HMGB1-wt、HMGB1-mut載體分別與miR-129-5p mimics、miR-129-5p inhibitor及相應陰性對照共轉染至MH7A細胞中;轉染48 h后,參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測MH7A細胞熒光素酶活性。實驗重復次數為3。

1.4 統計學方法

計量資料以平均數±標準差(±s)表示,運用SPSS 24.0軟件進行統計學分析,正態性檢驗采用Shapiro-Wilk方法,數據均符合正態分布,多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 塞來昔布對MH7A細胞活力的影響

經0、2.5、5、10、20和40 μmol/L塞來昔布處理后,MH7A細胞活力分別為(0.68±0.05)、(0.71±0.05)、(0.66±0.03)、(0.62±0.03)、(0.58±0.03)和(0.50±0.02)。與0 μmol/L比較,2.5、5、10 μmol/L塞來昔布處理后MH7A細胞活力差異無統計學意義(P＞0.05),但20和40 μmol/L塞來昔布處理后MH7A細胞活力明顯降低(P＜0.05)。

2.2 塞來昔布對TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子分泌的影響

與對照組比較,誘導組MH7A細胞上清液中IL-6和IL-1β水平均明顯升高(P＜0.05);與誘導組比較,誘導+2.5 μmol/L塞來昔布組、誘導+5 μmol/L塞來昔布組和誘導+10 μmol/L塞來昔布組MH7A細胞上清液中IL-6和IL-1β水平均明顯降低(P＜0.05),且呈塞來昔布濃度依賴性(見表1)。

表1 各組細胞上清液中IL-6和IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 1 Comparison of IL-6 and IL-1β levels in cell supernatant of each group

表1 各組細胞上清液中IL-6和IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 1 Comparison of IL-6 and IL-1β levels in cell supernatant of each group

注:與對照組相比, *P＜0.05;與誘導組相比, #P＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the induction group, #P＜0.05.

組別Groups IL-6(pg/mL) IL-1β(pg/mL)對照組Control group 35.52±3.05 48.75±4.26誘導組Induction group 97.46±6.18* 125.63±9.55*誘導+2.5 μmol/L塞來昔布組Induction+2.5 μmol/L celecoxib group 85.68±5.02# 116.58±7.36#誘導+5 μmol/L塞來昔布組Induction+5 μmol/L celecoxib group 72.68±4.35# 91.07±6.21#誘導+10 μmol/L塞來昔布組Induction+10 μmol/L celecoxib group 55.75±3.23# 70.56±6.10#F 264.281 190.652 P＜0.001 ＜0.001

2.3 塞來昔布對TNF-α誘導MH7A細胞中miR-129-5p和HMGB1表達的影響

與對照組比較,誘導組MH7A細胞中miR-129-5p表達水平明顯降低,而HMGB1蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05);與誘導組比較,誘導+2.5 μmol/L塞來昔布組、誘導+5 μmol/L塞來昔布組和誘導+10 μmol/L塞來昔布組MH7A細胞中miR-129-5p表達水平明顯升高,而HMGB1蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05),且塞來昔布濃度越高變化越明顯(見圖1和表2)。

表2 各組細胞中miR-129-5p和HMGB1蛋白表達水平的比較(±s, n=9)Table 2 Comparison of miR-129-5p and HMGB1 protein expression levels in cells of each group

表2 各組細胞中miR-129-5p和HMGB1蛋白表達水平的比較(±s, n=9)Table 2 Comparison of miR-129-5p and HMGB1 protein expression levels in cells of each group

注:與對照組相比, *P＜0.05;與誘導組相比, #P＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the induction group, #P＜0.05.

組別Groups miR-129-5p HMGB1/GAPDH對照組Control group 1.00±0.00 0.20±0.02誘導組Induction group 0.23±0.03* 0.56±0.04*誘導+2.5 μmol/L塞來昔布組Induction+2.5 μmol/L celecoxib group 0.28±0.03# 0.45±0.03#誘導+5 μmol/L塞來昔布組Induction+5 μmol/L celecoxib group 0.36±0.04# 0.33±0.03#誘導+10 μmol/L塞來昔布組Induction+10 μmol/L celecoxib group 0.55±0.06# 0.24±0.03#F 630.193 212.840 P＜0.001 ＜0.001

2.4 miR-129-5p與HMGB1靶向關系的驗證

Targetscan Human軟件預測到HMGB1 3’UTR中存在能夠與miR-129-5p互補的結合位點。與相應陰性對照比較,miR-129-5p mimics可使轉染HMGB1-Wt載體質粒的MH7A細胞熒光素酶活性明顯降低,而miR-129-5p inhibitor可使其熒光素酶活性明顯升高(P＜0.05);同時,miR-129-5p mimics能使MH7A細胞中HMGB1蛋白表達水平明顯降低,而miR-129-5p inhibitor則使HMGB1蛋白表達水平明顯升高(見圖2和表3)。

表3 各組細胞熒光素酶活性及HMGB1蛋白表達水平的比較(±s, n=9)Table 3 Comparison of cell luciferase activity and HMGB1 protein expression level in each group

表3 各組細胞熒光素酶活性及HMGB1蛋白表達水平的比較(±s, n=9)Table 3 Comparison of cell luciferase activity and HMGB1 protein expression level in each group

注:與mimics-NC組相比, *P＜0.05;與inhibitor-NC組相比, #P＜0.05。Note.Compared with mimics-NC group, *P＜0.05.Compared with inhibitor-NC group, #P＜0.05.

組別Groups熒光素酶活性Luciferase activity HMGB1-wt HMGB1-mut HMGB1/GAPDH mimics-NC組mimics-NC group 1.00±0.00 1.00±0.00 0.22±0.03 miR-129-5p mimics組miR-129-5p mimics group 0.26±0.02* 0.94±0.08 0.09±0.02*inhibitor-NC組inhibitor-NC group 0.95±0.07 1.02±0.09 0.21±0.03 miR-129-5p inhibitor組miR-129-5p inhibitor group 1.72±0.12# 0.96±0.08 0.57±0.03#F 650.117 2.297 497.323 P＜0.001 0.096 ＜0.001

2.5 miR-129-5p過表達對TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子分泌的影響

與對照組比較,誘導組細胞中miR-129-5p表達水平明顯降低,而細胞上清液中IL-6、IL-1β水平明顯升高(P＜0.05);與誘導組比較,誘導+mimics-NC組上述指標差異均無統計學意義(P＞0.05);與誘導+mimics-NC組比較,誘導+miR-129-5p mimics組miR-129-5p表達水平明顯升高,而IL-6、IL-1β水平明顯降低(P＜0.05)(見表4)。

表4 各組細胞中miR-129-5p表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 4 Comparison of the expression level of miR-129-5p in the cells of each group and the level of IL-6 and IL-1β in the cell supernatant

表4 各組細胞中miR-129-5p表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 4 Comparison of the expression level of miR-129-5p in the cells of each group and the level of IL-6 and IL-1β in the cell supernatant

注:與對照組相比, *P＜0.05;與誘導+mimics-NC組相比, #P＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the induction+mimics-NC group, #P＜0.05.

組別Groups miR-129-5p IL-6(pg/mL) IL-1β(pg/mL)對照組Control group 1.00±0.00 33.85±3.25 46.85±5.02誘導組Induction group 0.21±0.02* 99.52±6.45* 128.47±8.96*誘導+mimics-NC組Induction+mimics-NC group 0.23±0.03 103.25±8.02 131.56±8.84誘導+miR-129-5p mimics組Induction+miR-129-5p mimics group 0.86±0.08# 62.38±5.26# 75.84±5.62#F 752.341 270.682 286.632 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 下調HMGB1表達對TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子分泌的影響

與對照組比較,誘導組細胞中HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平均明顯升高(P＜0.05);與誘導組相比較,誘導+NC-siRNA組HMGB1蛋白表達水平和IL-6、IL-1β水平差異均無統計學意義(P＞0.05);但誘導+HMGB1-siRNA組HMGB1蛋白表達水平和IL-6、IL-1β水平較誘導+NC-siRNA組均明顯降低(P＜0.05)(見圖3和表5)。

表5 各組細胞中HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 5 Comparison of HMGB1 protein expression level in cells of each group and IL-6 and IL-1β levels in cell supernatant

表5 各組細胞中HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 5 Comparison of HMGB1 protein expression level in cells of each group and IL-6 and IL-1β levels in cell supernatant

注:與對照組相比, *P＜0.05;與誘導+NC-siRNA組相比, #P＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the induction+NC-siRNA group, #P＜0.05.

組別Groups HMGB1/GAPDH IL-6(pg/mL) IL-1β(pg/mL)對照組Control group 0.20±0.03 35.08±3.11 49.05±4.35誘導組Induction group 0.55±0.04* 98.23±6.27* 129.68±10.02*誘導+NC-siRNA組Induction+NC-siRNA group 0.57±0.04 102.28±9.67 131.18±9.86導+HMGB1-siRNA組Induction+HMGB1-siRNA group 0.18±0.03# 68.86±4.12# 80.26±6.64#F 329.520 218.992 221.669 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001誘

注:A:對照組;B:誘導組;C:誘導+2.5 μmol/L塞來昔布組;D:誘導+5 μmol/L塞來昔布組;E:誘導+10 μmol/L塞來昔布組。圖1 Western blot檢測MH7A細胞中HMGB1蛋白表達Note.A, Control group.B, Induction group.C, Induction+2.5 μmol/L celecoxib group.D, Induction+5 μmol/L celecoxib group.E, Induction+10 μmol/L celecoxib group.Figure 1 Western blot detection of HMGB1 protein expression in MH7A cells

注:A:miR-129-5p與HMGB1 3’UTR結合位點;B:Western blot檢測miR-129-5p對HMGB1蛋白表達的影響。a:mimics-NC組;b:miR-129-5p mimics組;c:inhibitor-NC組;d:miR-129-5p inhibitor組。圖2 miR-129-5p與HMGB1靶向關系的驗證Note.A, miR-129-5p and HMGB1 3’UTR binding site.B, Western blot to detect the effect of miR-129-5p on the expression of HMGB1 protein.a, mimics-NC group.b, miR-129-5p mimics group.c, inhibitor-NC group.d, miR-129-5p inhibitor group.Figure 2 Verification of the targeting relationship between miR-129-5p and HMGB1

2.7 miR-129-5p低表達可逆轉10 μmol/L塞來昔布對TNF-α誘導MH7A細胞的影響

與誘導組比較,誘導+藥物組細胞中miR-129-5p表達水平明顯升高,而細胞中HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平明顯降低(P＜0.05);誘導+藥物+inhibitor-NC組和誘導+藥物組比較上述各指標差異均無統計學意義(P＞0.05);與誘導+藥物+inhibitor-NC組比較,誘導+藥物+miR-129-5p inhibitor組細胞中miR-129-5p表達水平明顯降低,而細胞中HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中IL-6、IL-1β水平明顯升高(P＜0.05)(見圖4和表6)。

表6 各組細胞中miR-129-5p和HMGB1蛋白表達水平以及細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 6 Comparison of the expression levels of miR-129-5p and HMGB1 protein in each group of cells and the levels of IL-6 and IL-1β in the cell supernatant

表6 各組細胞中miR-129-5p和HMGB1蛋白表達水平以及細胞上清液中IL-6、IL-1β水平的比較(±s, n=9)Table 6 Comparison of the expression levels of miR-129-5p and HMGB1 protein in each group of cells and the levels of IL-6 and IL-1β in the cell supernatant

注:與誘導組相比, *P＜0.05;與誘導+藥物+inhibitor-NC組相比, #P＜0.05。Note.Compared with the induction group, *P＜0.05.Compared with the induction+drug+inhibitor-NC group, #P＜0.05.

組別Groups miR-129-5p HMGB1/GAPDH IL-6(pg/mL) IL-1β(pg/mL)誘導組Induction group 1.00±0.00 0.57±0.05 96.48±6.13 128.48±10.02誘導+藥物組Induction + drug group 2.08±0.12* 0.25±0.03* 54.75±3.28* 67.56±5.35*誘導+藥物+inhibitor-NC組Induction+drug+inhibitor-NC group 2.11±0.10 0.24±0.03 55.60±3.47 69.15±6.03誘導+藥物+miR-129-5p inhibitor組Induction+drug+miR-129-5pinhibitor group 0.75±0.06# 0.48±0.03# 72.12±4.50# 94.48±6.85#F 651.471 190.385 170.465 137.859 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

注:A:對照組;B:誘導組;C:誘導+NC-siRNA組;D:誘導+HMGB1-siRNA組。圖3 Western blot檢測各組細胞中HMGB1蛋白表達Note.A, Control group.B, Induction group.C, Induction+NC-siRNA group.D, Induction+HMGB1-siRNA group.Figure 3 Western blot detects the expression of HMGB1 protein in each group of cells

注:A:誘導組;B:誘導+藥物組;C:誘導+藥物+inhibitor-NC組;D:誘導+藥物+miR-129-5p inhibitor組。圖4 Western blot檢測各組細胞中HMGB1蛋白表達Note.A, Induction group.B, Induction+drug group.C, Inductione+drug+inhibitor-NC group.D, Induction+drug+miR-129-5p inhibitor group.Figure 4 Western blot detection of HMGB1 protein expression in each group of cells

3 討論

塞來昔布是一種能夠緩解關節炎性癥狀的抗炎藥,可通過特異性抑制COX-2活性使炎性前列腺素生成減少,進而起到抗炎止痛的作用[10]。近年來,有研究指出,塞來昔布可通過抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核 因 子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路活性減輕軟骨組織炎性損傷發揮抗骨關節炎的作用[11];然而,塞來昔布對RA-FLSs炎癥的影響及其作用機制并不清楚。滑膜炎癥是RA典型的病理特征,而TNF-α誘導的滑膜細胞促炎因子IL-6和IL-1β等的分泌是該過程發生的重要因素[12];因此,TNF-α常被用作FLSs炎癥因子分泌的誘導劑[13-15]。本研究以20 ng/mL TNF-α刺激后發現,人RA-FLSs MH7A細胞上清液中促炎因子IL-6、IL-1β水平和MH7A細胞中HMGB1蛋白表達水平明顯升高,miR-129-5p表達水平明顯降低,而塞來昔布可劑量依賴性的降低IL-6、IL-1β和HMGB1表達水平,增加miR-129-5p表達水平。上述結果表明HMGB1及miR-129-5p參與RA滑膜炎癥的發生,二者有作為疾病潛在治療靶點的潛能,而塞來昔布抗RA滑膜炎癥的作用機制可能與調控miR-129-5p和HMGB1蛋白表達有關。

miR-129-5p是miRNAs家族成員,被報道在RA-FLSs中表達下調,且可通過調控胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)/Src/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/早期生長應答1(early growth response 1,Egr-1)信號通路調控RA細胞增殖和凋亡[4]。還有研究表明,miR-129-5p-TTK是控制早期RA進展的潛在RNA調節途徑[16]。CircASH2L通過抑制miR-129-5p / 同源域相互作用蛋白激酶2(homeodomain interacting protein kinase 2,HIPK2)軸來促進RA-FLS細胞的生長,運動和炎癥[17]。富含miR-129-5p的人滑膜間充質干細胞外來體(HS-MSC-Exo)顯著降低了軟骨細胞的炎癥反應和細胞凋亡[18]。本研究發現,miR-129-5p過表達可顯著抑制TNF-α誘導的MH7A細胞炎癥因子分泌,提示,miR-129-5p在RA滑膜炎癥過程中發揮著重要的抑制作用,其過表達可能是改善RA滑膜炎癥的重要策略。有研究指出,miR-129-5p過表達可通過靶向HMGB1減輕炎癥反應改善心力衰竭大鼠心功能和缺血再灌注后的神經損傷[18-19]。本研究雙熒光素酶報告基因實驗證實,miR-129-5p可與HMGB1靶向結合,HMGB1是miR-129-5p的靶基因。HMGB1是細胞核內一種非組蛋白,在細胞活性、凋亡和缺血/缺氧等異常情況下可被釋放至核外,激活下游相關因子啟動級聯式炎癥反應,與包括RA在內的多種免疫類疾病發生發展密切相關[20]。在RA患者關節液和關節滑膜中HMGB1存在異常高表達,且HMGB1可通過促進炎癥因子TNF-α和IL-17A等促進滑膜炎癥[21-23]。本研究發現HMGB1表達沉默可抑制TNF-α誘導的MH7A細胞上清液中IL-6、IL-1β水平。研究結果從反面證實,HMGB1在RA滑膜炎癥過程中發揮著重要的促進作用。此外,本研究還發現miR-129-5p表達沉默可逆轉塞來昔布對TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子分泌和HMGB1蛋白表達的抑制作用,結果提示,塞來昔布可通過上調miR-129-5p表達引起其靶基因HMGB1表達降低進而發揮抗RA滑膜炎癥的作用。

綜上所述,塞來昔布可抑制TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子分泌,其作用機制可能與激活miR-129-5p/HMGB1有關。然而,塞來昔布抗RA滑膜炎癥的作用機制可能還與其它基因或通路有關,還需后續進一步探討。