基于網絡藥理學分析沙棘治療風濕性心臟病的作用機制

萬敬強，郭振東，馬永霞，謝萍

（1.甘肅中醫藥大學 第一臨床醫學院,甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院 心內科,甘肅 蘭州 730000）

0 引言

風濕性心臟病（rheumatic heart disease，RHD），是由A組B溶血性鏈球菌感染所致（多為咽頰炎），其機制與鏈球菌感染后異常免疫反應有關，心瓣膜受損是風濕熱最嚴重的臨床表現，主要累及二尖瓣和主動脈瓣。本病早期可無癥狀，隨著瓣膜狹窄與關閉不全的逐漸加重，最終發展為頑固性心力衰竭，需要外科換瓣治療[1]。目前主要治療方式為定期肌肉注射抗生素控制疾病的發展，盡管如此，仍有部分患者預后不良，最終發展為心力衰竭。流行病學研究發現RHD占所有心血管死亡的1.6%，每年全球約30萬人死于RHD[2]。西醫對風濕性心臟病的發病機制認識不明，可能機制與鏈球菌感染后異常免疫反應有關，迄今為止，無特效藥物，現迫切需要開發毒副作用較小的藥物。

沙棘廣泛分布于我國西北、華北等地，研究發現其具有抗炎、抗氧化、利肝、降脂、保護心血管等藥理活性[4]。沙棘中發揮保護心血管作用的當屬黃酮類物質，其主要通過調節Ca2+信號通路、ROS信號通路等信號途徑，參與調節脂質代謝、氧化應激、保護內皮細胞等過程，來改善心功能[5]。

網絡藥理學是藥理學和生物信學的結合學科，通過網絡分析，闡明藥物-疾病-通路的潛在關系，為中醫藥新藥研發與老藥新用提供一定的理論基礎[3]。與此同時，網絡藥理學旨在闡明中藥整體性和人體疾病之間的對應關系，與中醫藥整體觀、辨證論治的原則相吻合[6]。因此，本文基于網絡藥理學分析沙棘治療風濕性心臟病的可能靶點和分子通路，為臨床研究提供依據。

1 方法和資料

1.1 數據庫與軟件來源

網絡藥理學研究以網絡數據庫平臺為主[7]，本文所用數據庫網址見表1。

表1 本文所用數據庫網址

1.2 方法

1.2.1 沙棘中目標化合物篩選

以“沙棘”為關鍵詞，在TCMSP數據庫中檢索，以OB≥30%和DL≥0.15為限定條件。利用PubChem數據庫查詢以上活性成分的化學結構式和PubChem CI[8]。

1.2.2 沙棘活性成分作用靶點收集

通過TCMSP檢索獲得沙棘活性成分對應的靶點。將每種成分對應的靶點以表格形式保存至EXCEL中，分類去重處理后，讓數據更有條理性，以便后續的統計操作。利用UniProt知識庫，搜索獲得沙棘活性成分靶點對應的基因，選擇分類為Human/Homo（人類）的基因，保存至相應蛋白靶點之后[9]。

1.2.3 風濕性心臟病相關基因檢索

將風濕性心臟病、風濕性心肌炎等詞輸入pharmaGKB、Disgenet、OMIM數 據 庫，篩 選 出疾病潛在靶點，下載搜索結果并保存為EXCEL格式。

1.2.4 藥物作用靶標與風濕性心臟病靶標的獲取

將沙棘活性成分作用靶點對應的基因集復制粘貼至新的EXCEL中，剔除重復項后與RHD的相關靶點取交集，從而篩選出沙棘治療RHD的共同靶點。

1.2.5 沙棘活性成分靶標構建

將Pelargonidin、canthaxanthine、carotenoid、cislycopene、delta-Carotene、ergosta-7-en-3-betaol、ergostenol、gamma-carotene、LAN、Mandenol、rhein、24-epicampesterol、beta-carotene、isorhamnetin、beta-sitosterol、Schottenol、CLR、quercetin等活性成分的靶標上傳到 Cytoscape 3.8.0軟件中，構建沙棘活性成分靶標網絡。

1.2.6 靶標互作（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

在STRING數據庫首頁，選擇“Multiple Proteins”選項，在List of Name欄輸入沙棘和風濕性心臟病的交集靶標，Organism選擇為“Homo Sapiens”，然后點擊Search進入，在Setting選項欄選擇將相互作用閾值設置為“Medium Confidence（中等置信度）”0.4[10]，獲得藥物與疾病靶標相互作用關系，將獲得的數據導出EXCEL中。最后利用Cytoscape3.8.0軟件進行蛋白網絡關系圖的制作。

1.2.7 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將沙棘和風濕性心臟病疾病的交集靶標導入DAVID數據庫中，Select Identifier選擇“OFFICIAL_ GENE_SYMBOL”,List Type選 擇“Gene List”，Organism選 為“Homo Sapiens”，點擊Functional Annotation Tool后 再 選 取“Gene Ontology”下 的“GOTERM_BP_DIRECT”以 及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”將數據導出，然后再應用微生信平臺進行數據可視化處理。

2 結果

2.1 沙棘有效成分篩選

以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18 為篩選條件，通過TCMSP數據庫篩得到18種沙棘的活性成分。如表2所示。

表2 沙棘治療RHD主要活性成分及靶點

2.2 沙棘活性成分的網絡構建

如圖1所示，該網絡包括472條邊和18個節點，連接數較多的節點在整個網絡中起著舉足輕重的作用，可能是核心活性成分或者關鍵靶點。其中異鼠李素（isorhamnetin）、大黃酸（cislycopene）、槲皮素（quercetin）、亞油酸乙酯（Mandenol）等具有較強的藥理活性。

圖1 沙棘與風濕性心臟病交集靶點Venn圖

2.3 沙棘與風濕性心臟病靶標PPI網絡構建

沙棘與風濕性心臟病共同靶標共包括37個節點，如圖2。Degree值越大則節點顏色越深，且節點越接近圖中圓心，如圖3。沙棘治療風濕性心臟病的靶標中Degree值排名前4位的靶標為STAT3、AKR1C3、TNF、MMPs。

圖2 沙棘活性成分網絡圖（PPI）

圖3 沙棘治療風濕性心臟病共同靶標PPI網絡圖

圖4 活性成分對應靶標的GO生物過程分析

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析

沙棘治療風濕性心臟GO富集分析發現，沙棘作用途徑大多與膠原蛋白代謝過程、細胞外基質分解、MAPK的激活、基因表達調控、RNA聚合酶Ⅱ促進器轉錄的正調控等有關；KEGG富集分析發現，沙棘可調節TNF信號通路、代謝信號轉導通路、HIF-1信號通路等來發揮作用。

3 討論

在沙棘-活性成分-靶標網絡圖分析發現，一種活性成分作用于多個靶標、通路，這恰巧體現中醫的整體優勢。其中槲皮素、異鼠李素屬于黃酮類化合物，具有較強的抗氧化活性，可直接清除心肌組織中的超氧歧化物、自由基、過氧化氫等氧化性物質，刺激心肌細胞產生超氧歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等還原性物質，從而發揮抗炎抗氧化功能，保護心肌組織。研究表明槲皮素可通過抑制ROS過度生成而抑制P38-MAKP介導的心肌纖維化的發生[11]；槲皮素通過改善糖尿病大鼠心肌組織的氧化應激、炎癥和細胞凋亡而減輕心肌損傷[12]；研究表明，異鼠李素通過影響線粒體凋亡途徑和激活Nrf2/ARE信號通路來保護心肌細胞免受H2O2誘導的損傷[13]。異鼠李素通過抑制氧化應激、線粒體凋亡途徑和MAPK信號轉導途徑改善阿霉素誘導的心肌損傷[14]。有研究表明大黃酸要用價值高，研發前進廣泛，大黃酸具有抗腫瘤、抗纖維化、調脂、降血糖、抗菌抗病毒等廣泛的藥理活性，廣泛應用于心血管疾病[15]。

圖4 活性成分對應靶標的KEGG通路富集分析

風濕性心臟病PPI網絡中靶標STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、MAPK14 高表達。STAT3作為信號傳感器和活化劑是由多種生長因子和細胞因子參與的關鍵信號蛋白，能夠引起不同的生物結果，包括細胞生長、分化和存活[16]。AKR1C3是醛酮還原酶超家族的家族成員之一,目前研究發現與多種腫瘤發病密切相關。TNF-α作為炎性指標，在多種惡性腫瘤、各器官功能衰竭、感染性疾病[17]等病理條件下均升高。其中MMP家族矩陣金屬蛋白酶 （MMPs）是蛋白分解酶家族，在細胞外基質（ECM）組件的降解和合成中非常重要[18]。IGFBP-3是調節細胞增殖、凋亡和纖維化等細胞過程的基本蛋白質，執行各種生理功能[19]。MAPK14作為p38MAPK信號通路的關鍵分子，是多種激活下游多種炎癥的核心環節，在病原微生物感染引起的免疫應答過程中發揮重要作用[20]。上述關鍵靶標其中TNF-α、MAPK14介導了炎癥因子的合成與釋放，說明沙棘在風濕性心臟病治療中發揮抗炎具有重要意義。IGFBP-3、MMPs與纖維化通路密切相關，表明沙棘在治療RHD晚期頑固性心力衰竭中具有重要意義。

GO 生物過程主要集中于氧化應激、細胞外基質的沉積、膠原蛋白活化、MAKP通路。KEGG通路分析結果顯示:通路主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路，關于TNF信號通路，TNF-α抑制β-腎上腺素能受體，負反饋導致交感神經激素分泌增加，進一步促進機體釋放促炎因子，加重了組織細胞損傷，同時激活心肌肥厚和心力衰竭的信號通路[17]。HIF-1α是一種氧敏感轉錄因子，在常氧條件下極易被降解，因此，當發生心肌缺血時，受損的心肌細胞與內皮細胞可釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列細胞炎性因子引起局部炎癥反應，從而加重組織損傷[21]。

本文基于網絡藥理學方法，構建沙棘治療RHD的“成分-靶點-通路”作用機制。結果表明，沙棘主要是以黃酮類化合物槲皮素、異鼠李素等18種活性成分為物質基礎，以STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、STAT3、MAPK14等8個蛋白作為主要作用靶點，經由TNF信號通路，HIF-1α信號通路等抗炎抗氧化相關通路起到治療作用。因此，本文預測的沙棘“多成分-多靶點-多通路”的作用機制，可為進一步深入開展沙棘治療風濕性心臟病作用機制研究提供新的路徑和方向。