茯苓枸杞飲提取工藝及其對黃嘌呤氧化酶作用

陳安利， 陳艷熙， 馬 卓

(湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068)

長期體內嘌呤代謝活躍、攝入嘌呤量過多或尿酸無法正常排泄，均會導致高尿酸血癥，從而誘發痛風等疾病[1]。黃嘌呤氧化酶(XOD)主要參與體內嘌呤的代謝，通過催化次黃嘌呤和黃嘌呤的氧化羥基化反應產生尿酸(UA)，是產生UA的關鍵酶[2]。XOD活性過高會導致產生UA增多，從而引發高尿酸血癥。XOD抑制劑是治療痛風的主要藥物，國內使用最多的XOD抑制劑為別嘌呤醇、苯溴馬隆、非布司他等[3]。這類藥物雖對痛風有很大的緩解作用，但是對腎臟的損傷也較大。因此，有待研發新的對XOD有抑制作用且對人體傷害較小的XOD抑制劑。

茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，藥典記載茯苓味甘、淡、平，歸肺、脾、腎經，有利水消腫的功效，是一種較為常見的利尿中藥[4]。且有關研究表明，茯苓中含有大量的多糖和三萜酸類化合物，具有抗炎、保肝、利尿等生理活性[5-7]。郭花斌[7]等研究發現，茯苓提取液可減少腎小管對尿酸的重吸收，并通過抑制XOD的酶活性達到降低尿酸的作用；枸杞屬于茄科枸杞屬的落葉灌木植物[9]，其中含有多種生物活性成分，主要有多糖、類胡蘿卜素、類黃酮、甜菜堿等，具有補腎、補臟、抗氧化和抗腫瘤等作用[10-11]；桑葚作為藥食同源中藥材，含有黃酮、多糖、花色苷、多酚等生物活性成分，具有抗氧化、防衰老、補肝益腎等保健作用[12-13]。均可作為研發XOD抑制劑的參考。

本實驗通過考察茯苓、枸杞、桑葚等藥食同源中藥材的最佳提取工藝，得到其最佳提取工藝，并通過體外XOD活性檢測，判斷茯苓枸杞飲的抑制效果。旨在為開發預防和治療痛風藥食同源產品提供基礎和思路，也是為茯苓枸杞飲的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓、枸杞、桑葚等(均購于武漢市一家中藥藥店，經湖北省中醫院馮漢鴿主任藥師鑒定符合《中國藥典》2020版標準)。

葡萄糖標準品(HP，博美生物科技有限公司)；黃嘌呤氧化酶(50 U/mg，上海麥克林生物科技有限公司)；黃嘌呤(色譜純≥99.5%，上海麥克林生物科技有限公司)；苯酚、濃硫酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲醇(均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器與設備

RE-2000A旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；YH02211805025雙光束紫外分光光度計(上海佑科科技有限公司)；鼓風干燥箱；DK-8D電熱恒溫水浴鍋(予華儀器有限公司)；TEG16G高速臺式離心機(上海精宏有限公司)；DS-5510超聲波清洗器(予華儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1提取方法選擇對于中藥材，煎煮法是最為傳統的提取方式[14]，是藥食同源中藥材最安全、較經濟的提取方法，該方式在現代食品、藥品加工中也有廣泛的應用，適合食品藥品加工生產大規模進行。并且茯苓枸杞飲中含有豐富的多糖、黃酮類化合物、萜類化合物等，這些有效成分均可溶于水。所以本實驗選擇水煎煮法對茯苓枸杞飲進行提取制備。

1.3.2提取液制備按照給定的處方量，稱取一定比例的茯苓、枸杞、決明子等藥材，共85 g，加入一定量的水煎煮，合并浸提液后趁熱用200目濾布過濾，減壓濃縮，根據藥典規定提取液的相關要求，濃縮至所得提取液的相對密度為1.08左右。

1.3.3茯苓枸杞飲中多糖得率的測定由于茯苓枸杞飲中茯苓及枸杞含有大量的多糖，且研究表明[15]，茯苓多糖可以通過上調rOAT1的表達以及下調r URAT1的表達，從而增加了尿酸的排泄，起到治療痛風的作用。因此，可選用測定多糖含量作為指標，采用苯酚-硫酸法[16]進行測定。

1)標準曲線的建立 精密稱取葡萄糖標準品，用紫外分光光度計進行測定。以吸光值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖1)，得線性回歸方程為y=0.012x-0.0128,R2=0.9995 ，表明葡萄糖標準曲線在10 ～50 mg范圍內線性關系較好。

圖1 葡萄糖標準曲線

2)多糖得率的計算 多糖得率

式中：m1表示總糖含量，mg；m0表示還原糖含量，mg；M表示藥材干重，g。

1.3.4干膏得率的測定將蒸發皿干燥至恒重m0，精密吸取提取液置于恒重的蒸發皿中，精密稱定質量m1，水浴上蒸干提取液得浸膏，于105 ℃下干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，快速精密稱定質量m2。干膏得率

1.3.5單因素實驗設計

1)加水倍數：按照處方量稱取茯苓枸杞飲，共85 g，加入4、6、8、10、12倍水，煎煮2 次，每次2 h；

2)煎煮時間：按照處方量稱取茯苓枸杞飲，共85 g，加入6倍水，煎煮2 次，每次煎煮30、60、90、120、160 min；

3)煎煮次數：按照處方量稱取茯苓枸杞飲，共85 g，控制煎煮次數為1、2、3次，加入6倍水，每次煎煮60 min。

通過對多糖得率和干膏得率進行比較，得最佳單因素條件。

1.3.6正交實驗設計根據前期單因素實驗，選擇加水倍數、煎煮時間、提取次數為水提工藝的主要因素，按三因素三水平表進行 L9(34)正交實驗，以多糖得率、干膏得率為評價指標進行實驗(表1)。

表1 茯苓枸杞飲正交實驗設計

1.3.7驗證實驗按照最終優化工藝條件，做3份平行實驗，分別測定多糖得率和干膏得率，若實驗結果與正交試驗結果相近，說明優化的工藝條件具有可行性。最終得到由85 g藥材制成300 mL溶液。

1.3.8茯苓枸杞飲與苯溴馬隆對XOD酶活力的影響黃嘌呤在 XOD 的作用下可以產生UA，產物UA在特定的波長下可作為檢測XOD抑制率的依據。參考陳雨涔等采用的方法[17-18]，對實驗條件進行優化。

1)檢測波長的確定 利用紫外分光光度計在250～350 nm波長范圍內掃描波長，來檢測黃嘌呤與XOD的反應產物的最佳檢測波長。

2)酶濃度與吸光值的關系 配置不同濃度的XOD，酶濃度分別為50、100、200、400、800 μg/mL，加入1 mL黃嘌呤啟動反應，在最佳反應波長下進行檢測，以酶濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪圖，確定最適酶溶液濃度。

3)茯苓枸杞飲與苯溴馬隆對XOD酶活力的檢測 樣品的配置：在最佳工藝條件下，取0.1 mL茯苓枸杞飲加入在0.2 mL最佳濃度的XOD中，再取2 mL緩沖溶液混勻，36 ℃靜置2 h，加入1 mL黃嘌呤啟動反應，進行檢測；陽性對照的配置：將苯溴馬隆取2.0 mg，用1 mL緩沖溶液溶解后，同上取0.1 mL后進行處理檢測；空白對照排除試劑本身對實驗的干擾。

對XOD的抑制率

式中：A0表示陰性對照組吸光值；A1表示陽性(樣品)對照組吸光值；A2表示陽性(樣品)空白組吸光值；A3表示陰性空白組吸光值。

根據85 g藥材制成300mL的茯苓枸杞飲合劑。分別測定濃度為283，200，100，50，15. 625 mg/mL 的茯苓枸杞飲合劑對 XOD 的抑制率，將茯苓枸杞飲合劑濃度與抑制率進行回歸，得到回歸方程，計算抑制率為50%時的藥物濃度，即半數抑制濃度( IC50)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

根據圖2可知，茯苓枸杞飲的最佳工藝條件為加水倍數為8倍、浸提時間60 min、浸提次數2次。分析可知：

(a)加水倍數

(b)煎煮時間

(c)浸提次數圖2 單因素實驗結果

1)隨加水倍數的增加，多糖得率和干膏得率呈先增加后下降趨勢，可能原因是當加水量過少，飲片未能浸泡完全，有效成分及其他物質溶出率低；當加水量過多，飲片中的有效成分已充分溶出，加水只能改變體積，起到稀釋作用，從而降低。當加水倍數為8倍水時，多糖得率和干膏得率達到最大值。

2)隨著煎煮時間的增加，多糖得率和干膏得率呈現先增加后下降的趨勢，可能是提取時間太短使得飲片中溶出的成分過少；長時間提取會使溶出的成分被破壞。多糖得率和干膏得率在提取1 h時達到最大值。

3)多糖得率和干膏得率在提取2次后達到最大值，可能原因是提取次數過少，飲片成分不能充分溶出；提取次數過多，溶出的成份被破壞或成分之間發生相互作用使含量降低。

2.2 正交實驗結果分析

2.2.1正交結果分析根據上述單因素實驗結果，選擇加水倍數、煎煮時間、提取次數為水提工藝的主要因素，按單因素考察結果設置的水平進行正交試驗。

根據主觀權重賦權法，參考相關文獻[17]，得出綜合評分的權重系數為：多糖得率(70%)、干膏得率(30%)，試驗結果如表2所示。

表2 正交實驗結果

R值的大小反映了實驗中各因素對所測指標的影響程度，R值越大則表示該因素對實驗結果的影響越大。由表2可知，根據綜合權重比較，浸提次數對實驗指標的影響最大的，其次是加水倍數和浸提時間。初步分析得最佳工藝為：加8倍水、浸提3次、每次90 min。

2.2.2方差分析方差分析結果見表3，可知浸提次數有顯著差異，與上正交分析表結果相同。考慮成本等因素，綜合考慮最佳提取工藝為：8倍水先浸泡30 min后，浸提3次，每次90 min。

表3 綜合方差分析

2.3 驗證實驗

按照正交實驗最優條件(加8倍水，提取3次，每次90 min)，做3次平行，測得多糖得率及干膏得率，結果如表4所示。實驗結果綜合評分為31.22±0.026分，比正交結果好且數據穩定，說明該工藝條件具有可行性。

表4 驗證實驗結果

2.4 茯苓枸杞飲與苯溴馬隆對XOD酶活力的影響結果分析

2.4.1最佳檢測波長的確定

由圖3可知，黃嘌呤和尿酸分別在270 nm和290 nm處有最大吸收波長，將不同濃度的XOD中加入黃嘌呤啟動反應，如圖4所示，均在290 nm處有最大吸收波長，且證明黃嘌呤與XOD反應后的產物為UA。

圖3 黃嘌呤與尿酸掃描波長

圖4 不同濃度XOD底物掃描波長

2.4.2最佳XOD濃度的確定由圖5可知，在10～100 μg/mL范圍內，加入黃嘌呤的XOD反應體系的吸光度隨著濃度的增加而不斷增加。當濃度達到200 μg/mL時，吸光度達到最大，為1.884，之后隨著濃度的增大吸光值在1.884范圍上下波動。綜上，最佳XOD濃度為200 μg/mL。

圖5 吸光值與XOD濃度關系

2.4.3茯苓枸杞飲對XOD活力的影響

根據表5可知，茯苓枸杞飲對XOD活力的抑制率可達到43.79%，與苯溴馬隆抑制率62.99%較接近，由此可作為預防痛風，抑制尿酸生成的預防型保健品。

表5 抑制率表

3 結論

通過單因素和正交實驗可知，茯苓枸杞飲的最佳工藝條件為加8倍量的水、浸提時間60 min、浸提次數2次。且通過重復性實驗驗證，按此工藝參數，可制備品質穩定的茯苓枸杞飲飲品。且在290 nm處、酶濃度200 μg/mL條件下，茯苓枸杞飲相對于苯溴馬隆，對XOD一定的抑制作用，且抑制率為(43.76±0.685)%。該實驗為后期研發具有預防痛風的功能性食品提供了實驗基礎和思路。

StudyonExtractionTechnologyofPoriaCocosand