表達人源PD-L1的4T1細胞系的構建

王 迪， 王潤楊， 楊俊寒， 張 樂， 胡 翰， 汪 洋， 劉濱磊

(湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068)

PD-L1又稱程序性死亡配體1，是共刺激分子B7家族成員之一，由CD274基因編碼。PD-L1分子不僅廣泛表達于活化T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等[1]，在許多腫瘤細胞中也高表達，如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤細胞等[2-3]。PD-L1與PD-1(程序性死亡受體1)結合傳遞免疫抑制信號，抑制T、B細胞增殖分化和細胞因子等的產生[4]。PD-1/PD-L1途徑在誘導維持外周免疫耐受、自身免疫疾病、移植排斥反應、腫瘤免疫疾病等中發揮關鍵作用。PD-1/PD-L1免疫療法在針對晚期或轉移性乳腺癌的部分臨床試驗中顯示出了良好的療效[5]。但是PD-L1的過表達是否與乳腺癌的不良預后密切相關仍存在爭議[6]。為更好地了解PD-L1在腫瘤細胞中的作用和機制，本研究構建了穩定表達人源hPD-L1的單克隆細胞株，并將構建成功的4T1-hPD-L1細胞系皮下植入BALB/c小鼠的右側背部，觀察腫瘤生長情況。

1 實驗材料

hPD-L1基因片段，金斯瑞生物科技股份有限公司；PBDP轉座酶輔助質粒，System Biosciences公司；小鼠乳腺癌4T1細胞，北京協和醫院細胞資源中心；細胞培養所用DME/F-12培養基，美國HyClone公司；胎牛血清，四季青；嘌呤霉素，德國Biofroxx公司；抗人源PD-L1鼠單克隆抗體，美國BD公司；Lipofactamine3000轉染試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；質粒小提試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠，湖北省疾病控制中心。

2 實驗方法

2.1 4T1細胞嘌呤霉素敏感性實驗

收集T-75cm2培養瓶中的4T1細胞，以每孔2×105個細胞接種在12孔板中，于37℃恒溫、5% CO2濃度的細胞培養箱中培養。第2 天更換培養基，避光加入不同濃度梯度的嘌呤霉素。連續7 d觀察記錄細胞存活率，以4 d內殺死孔板中所有細胞的最低嘌呤霉素濃度為最佳篩選濃度[7]。

2.2 質粒提取

hPD-L1基因片段由金斯瑞公司合成。冰上解凍大腸桿菌感受態DH5α，加入2 μL質粒，冰上靜置10 min，42℃水浴熱激90 s，冰上靜置5 min，涂LB-Amp平板，37℃倒置培養過夜。第2 天挑取單菌落，接種在LB液體培養基中(含Amp抗性)，置于37℃搖床200 r/min振蕩培養14 h。參照諾唯贊質粒小提試劑盒說明書進行質粒提取。

2.3 細胞轉染

轉染前1 d，將4T1細胞以2×105個/mL細胞密度接種于12孔板。待細胞匯合度至85%，更換培養基。參照Lipofactamine3000說明書進行實驗操作。取兩個1.5 mL EP管，A管中加入95 μL DME/F-12培養基，5 μL P3000，20 μL PBDP-hPD-L1質粒和5 μL PBDP轉座酶輔助質粒(質粒與輔助質粒質量比為4∶1)；B管中加入125 μL DME/F-12培養基和3.75 μL Lipofactamine3000[8]。A、B管溶液混合，室溫孵育10 min，加入細胞孔板中，置于37℃恒溫、5% CO2濃度的細胞培養箱中培養。轉染48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞GFP表達情況，加入嘌呤霉素連續篩選7 d，每隔2～3 d更換培養基并補加嘌呤霉素。

2.4 單克隆細胞獲取

收集經嘌呤霉素篩選后的細胞，稀釋至500個/mL。取96孔板，每孔加入100 μL完全培養基(含10%胎牛血清的DME/F-12培養基)和2 μL細胞懸液，將細胞培養板置于37℃恒溫、5% CO2濃度的細胞培養箱中培養。7 d后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄只有單個細胞團且發綠色熒光的孔。當細胞匯合度達到80%，消化，依次擴大培養至12孔板、6孔板。

2.5 流式細胞術檢測4T1-hPD-L1細胞純度

收集1×106個培養在6孔板中的4T1-hPD-L1細胞，取野生型4T1細胞作為空白對照，加1 mL PBS洗1次，加入5 μL偶聯APC熒光染料的抗人源PD-L1鼠單克隆抗體，室溫避光孵育25 min。加1 mL PBS洗2次，用BD Accuri C6流式細胞儀對樣品進行檢測。用FlowJo V10軟件分析檢測結果。

2.6 4T1-hPD-L1成瘤性實驗

從湖北省疾控中心購買3只6周齡雌性的BALB/c小鼠。將4T1-hPD-L1細胞稀釋至1×107個/mL，在每只BALB/c小鼠右側背部皮下注射1×106個4T1-hPD-L1細胞(100 μL)[9]。7 d后觀察成瘤性，連續觀察40 d。用游標卡尺測量小鼠腫瘤體積大小，計算公式為：V=1/2×長徑×短徑×短徑。

3 實驗結果

3.1 PBDP-hPD-L1質粒構建

PBDP-hPD-L1轉座子載體質粒序列全長8102 bp。人源hPD-L1序列在NCBI上查找獲得(Gene ID: 29126)。hPD-L1基因由CMV強啟動子啟動轉錄。CopGFP和PuroR基因由T2A肽連接。連接后的序列由EF-1α核心啟動子啟動轉錄(5’LTR包含增強子等調控原件)，二者共享同一個polyA信號，由此構建PBDP-hPD-L1-GFP質粒。

3.2 4T1細胞轉染

PBDP-hPD-L1質粒和PBDP轉座酶輔助質粒共同轉染4T1細胞，轉染48 h后，在倒置熒光顯微鏡下能觀察到細胞發綠色熒光。

圖1 PBDP-hPD-L1質粒圖譜 圖 2 PBDP-hPD-L1轉染4T1 48h

3.3 4T1-hPD-L1細胞挑取單克隆、擴培

將4T1-hPD-L1細胞稀釋至500個/mL，在96孔板中培養7 d后，可在倒置熒光顯微鏡下觀察到單個且帶有綠色熒光的細胞團。將細胞擴培(圖3)。

圖3 4T1-hPD-L1單克隆細胞擴培

3.4 流式細胞術檢測4T1-hPD-L1單克隆細胞

流式檢測對照組4T1細胞和實驗組4T1-hPD-L1細胞中GFP和PD-L1的表達量，結果顯示實驗組細胞雙陽性率為97.0%(圖4)。

圖4 4T1-hPD-L1單克隆細胞GFP和PD-L1表達

3.5 4T1-hPD-L1腫瘤模型建立

將4T1-hPD-L1細胞皮下植入BALB /c小鼠右側背部，3只小鼠背部均長出瘤塊，14 d后體積生長至100 mm3，成瘤率達100%。繪制腫瘤生長曲線(圖5)，腫瘤體積隨著時間增長而增加。

圖5 BALB/c皮下腫瘤生長曲線

4 結束語

PD-L1通過與PD-1結合抑制T細胞功能，從而使腫瘤發生免疫逃逸，阻斷PD-1/PD-L1通路成為目前免疫治療的研究熱點[10]。目前國內外已有3種PD-L1單克隆抗體藥物被批準上市，可用于治療非小細胞肺癌和尿路上皮癌等癌癥。但PD-L1抗體藥物并非對所有患者有效，原因可能和原發性耐藥、繼發性耐藥、腫瘤突變負荷、患者體內PD-L1表達量不同等相關[11]。

轉座子是一段可插入宿主基因組內并改變位置的DNA序列。通過將外源基因引入到特定的細胞、組織中，轉座子系統廣泛應用于基因敲除、誘導突變、轉基因動物等實驗研究中[12]。通過轉座子系統構建PD-L1高表達的腫瘤細胞，可為研究PD-L1抗體藥物提供參考。

本實驗采用脂質體將PBDP-hPD-L1質粒和PBDP轉座酶輔助質粒轉入小鼠乳腺癌4T1細胞中，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率；經過嘌呤霉素篩選、有限稀釋法獲得單克隆細胞系；通過流式細胞術檢測細胞中GFP和PD-L1雙陽性率為97.0%，成功構建穩定表達GFP和人源hPD-L1的鼠乳腺癌4T1-hPD-L1細胞系。將構建成功的細胞系皮下植入BALB/c小鼠背部，建立乳腺癌皮下腫瘤模型。此模型的成功構建為研究PD-L1抗體藥物提供了穩定可靠的動物模型，為進一步研究PD-L1分子的功能提供參考。