畸胎瘤衍生生長因子1對宮頸癌細胞體內外增殖的作用分析

楊亞楠，許晴晴，兀紫夢，任琛琛

（鄭州大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450000）

1 背景

宮頸癌是起源于于女性宮頸的一種惡性腫瘤，主要發生于育齡期及絕經期女性，在2020年全球女性惡性腫瘤發病中占7.7%，在因惡性腫瘤死亡的女性患者中，宮頸癌占6.4%，僅次于肺癌，結直腸癌，乳腺癌，是女性癌癥發病中第四常見的疾病[1]。在世界范圍內的欠發達地區，宮頸癌的發病率較高，居女性惡性腫瘤的第2位[2,3]。對早期的宮頸癌患者，行根治性子宮切除術可提高患者的生存率。有研究表明，對腫瘤具有高級別特征，如切緣細胞受累，淋巴結轉移，宮旁侵犯及遠處轉移的宮頸癌患者，術后使用輔助外照射放射治療同時進行鉑類化療，可提高患者的總生存期和無進展生存期。對有中等危險因素的宮頸癌患者，使用輔助外照射放射治療可減少宮頸癌患者的局部復發[4]。

畸胎瘤衍生生長因子1（Teratocarcinomaderived growth factor1，TDGF-1）又稱Cripto-1，由于存在修飾的EGF樣結構域而被歸類于表皮生長因子相關肽家族[5]，在許多癌變及癌前病變，如胃腸上皮化生及乳腺導管原位癌中過表達[6]。除了干細胞，Cripto-1在正常組織中的表達水平很低[6]。在致癌轉化過程中，Cripto-1在幾種類型的人類癌癥中重新表達，包括胃癌、結直腸癌、胰腺癌，乳腺癌等。在生殖系統惡性腫瘤如卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、前列腺癌等中Cripto-1的表達量亦有升高[7]。在腫瘤的發生過程中，Cripto-1可通過激活多種細胞內外信號通路，調節腫瘤細胞的增殖遷移侵襲，并與腫瘤細胞的放療抵抗和化療耐藥有關[8]。有研究表明，Cripto-1亦可以激活經典wnt通路，引起頭頸部鱗狀細胞癌等多種癌細胞的增殖遷移及上皮間質轉化[9]。本課題通過一系列體內外實驗，研究了Cripto-1在體內外對宮頸癌細胞的增殖的作用。

2 材料與方法

2.1 材料

人Hela及SiHa細胞為鄭州大學第三附屬醫院科研中心饋贈。為構建低表達Cripto-1因子的穩轉宮頸癌細胞，我們委托上海吉凱基因生物公司，構建靶向沉默Cripto-1的慢病毒，該病毒載體為GV344，序列信息為：hU6-MCSUbiquitin-firefly_Luciferase-IRES-puromycin。

雌性裸鼠（4周齡，體重13-16g）購自北京SPF生物技術有限公司。實驗前1周在鄭州大學實驗動物中心實驗室飼養，以適應環境。這項動物研究的倫理申請由鄭州大學動物研究倫理委員會批準。動物實驗遵循《實驗動物的照料和使用指南》。Cripto-1基因引物和GAPDH引物購自尚亞生物，兔抗人Cripto-1單克隆抗體和E-cadherin單克隆抗體購自CST公司，MMP-9單克隆抗體購自艾博抗公司，抗GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 TCGA數據庫

從TCGA中下載宮頸癌原始數據，包括臨床預后數據，病理參數和Cripto1 mRNA表達水平，分析mRNA表達水平的差異與臨床預后的關系，并進行生存曲線分析。

2.2.2 細胞培養及轉染

Hela及SiHa細胞培養于高糖DMEM培養基中，培養基中含體積分數為10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素。將培養瓶置于37℃、體積分數為5%的CO2恒溫密閉培養箱中進行培養、消化和傳代。使用慢病毒感染兩株細胞，慢病毒載體為GV344載體。于六孔板中培養細胞，生長至20% -30%匯合度時，轉染慢病毒載體。培養72小時之后，用0.25μg/mL的普利茅斯篩選單克隆細胞系，通過qrt-pcr檢測驗證Cripto-1的敲減效率。

2.2.3 RT-PCR

使用Trizol試劑從指定的細胞系中提取總RNA。利用反轉錄試劑盒合成cDNA，應用SYBR Premix Ex Taq Kit系統為基礎，建立了熒光定量PCR的方法。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT方法進行數據分析及表達水平測定。β-actin引物序列為Foward：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；Reserve：5’-AGGTCTTTGCGGATG TCCACGT-3’，Cripto-1引物序列為：Foward：5’-CAGGAATTTGCTCGTCCATCTCGG-3’；Reserve：5’-TAGTACGTGCAGACGGTGGTAGTT-3’。

2.2.4 Western-blot

轉染后48h收集各組的細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白液。BCA法測定蛋白濃度，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，進行SDS-PAGE電泳，再將電泳產物電轉至PVDF膜上。含5%的脫脂牛奶搖床上封閉1h后，分別加入稀釋好的Cripto-1、E-cadherin、MMP9和GAPDH（稀釋比均為1:1000）的抗體中，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次×10min。加入山羊抗兔免疫熒光二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。TBST洗膜3次×10min。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software測定Western blot條帶凈灰度值，并與內參照GAPDH的測定結果相比較，計算其比值。

2.2.5 CCK-8實驗

用CCK-8法檢測細胞增殖情況。在96孔板中接種細胞，密度為2×103個細胞/孔，在培養24，48，72，96小時后分別加入CCK-8試劑，繼續培養2小時。使用酶標儀在450nm出測定每個孔的吸光度。

2.2.6 克隆形成實驗

取對數生長期SiHa細胞及HeLa細胞，消化計數后，分別將2×103細胞接種于6孔培養板，每孔2mL單細胞懸液。培養10～14天，每天觀察克隆形成情況，每3天更換培養基2次。至培養板中形成肉眼可見的克隆時，停止培養，以甲醇固定20min，0.2%結晶紫染液染色30min，最后于倒置顯微鏡下計數≥50個細胞數的集落為有效細胞集落，計算克隆形成率。

2.2.7 裸鼠異種移植瘤模型

將低表達Cripto-1慢病毒和陰性對照病毒穩定轉染的SiHa細胞分別接種于裸鼠兩側腋下（5×106個細胞，每組4只），接種后每3天測量腫瘤體積，18天后剝離瘤體，測量瘤體終體積及重量。排除意外原因小鼠的死亡，最終有效數據為4對4。這項動物研究的倫理批準是由鄭州大學動物研究倫理委員會批準。動物實驗遵循《實驗動物的照料和使用指南》。

2.2.8 數據分析

統計學分析使用了GraphPad Prism 8.0軟件和SPSS 26.0統計軟件進行了數據分析。計量資料使用算術均數±標準偏差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05視為有差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Cripto-1表達與宮頸癌預后相關

通過在線網站GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA數據庫中278例宮頸癌患者Cripto-1 mRNA與生存期的關系，其中，藍色曲線為Cripto-1低表達組，樣本量n=145；紅色曲線為Cripto-1高表達組，樣本量n=133。結果如圖1，圖2所示，在278例宮頸癌患者中，Cripto-1的表達與患者總存活時間之間無明顯關系（P＞0.05，如圖1），但與低表達組相比，高表達Cripto-1因子的宮頸癌患者無進展生存時間較短，差異有統計學意義（P＜0.05，如圖2），提示Cripto-1的表達可能減少宮頸癌患者的無進展生存時間。

圖1 Cripto-1表達水平與宮頸癌患者總生存率（Overall survival）的關系，P=0.85

圖2 Cripto-1表達水平與宮頸癌患者無瘤生存率（Diseasefree survival）的關系，P=0.015

3.2 Cripto-1促進宮頸癌的增殖

為構建低表達Cripto-1因子的穩轉宮頸癌細胞，我們委托上海吉凱基因生物公司，使用慢病毒GV344載體，構建了Cripto-1-RNAi慢病毒。RT-PCR及Western-Blot結果證明，構建完成的實驗組SiHa和HeLa穩轉細胞株中，Cripto-1因子的表達明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖3。RT-PCR及Western-Blot證實穩轉細胞株中Cripto-1因子的表達明顯降低，即成功構建低表達Cripto-1因子的SiHa和HeLa穩轉株。

圖3 RT-PCR和Western blot檢測慢病毒轉染效率。（A）四組細胞中Cripto-1及內參蛋白表達水平。（B）四組細胞中Cripto-1及內參蛋白表達定量分析。（C）敲減Cripto-1后HeLa細胞中Cripto-1 mRNA表達水平定量分析。（D）敲減Cripto-1后SiHa細胞中Cripto-1 mRNA表達水平定量分析。數據使用算術均數±標準偏差表示，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

利用Cripto-1 RNAi慢病毒建立穩定的SiHa和HeLa細胞低表達細胞系。兩株宮頸癌細胞系中的轉染效率均較高。利用兩株穩轉細胞株，我們采用克隆形成實驗及CCK-8實驗研究了Cripto-1對宮頸癌細胞增殖作用的影響。CCK-8實驗顯示，經過相同時間的培養，Cripto-1低表達組細胞在OD=450nm處的吸光度明顯低于對照組（P＜0.05，圖4）；同時，克隆形成實驗顯示，經相同時間的培養，Cripto-1低表達組集落形成數低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.001，圖5）。結果表明，Cripto-1基因的下調抑制了細胞增殖，并降低了宮頸癌細胞的克隆能力。

圖4 Cripto-1促進宮頸癌細胞的增殖。（A）CCK-8法檢測Cripto-1下調后HeLa細胞細胞連續4天的生長情況（B）CCK-8法檢測Cripto-1下調后SiHa細胞連續4天的生長情況.**P＜0.01，*P＜0.05

圖5 慢病毒處理后細胞的集落形成情況。（A、C）HeLa-Cripto1（-）組及HeLa-Vector組克隆形成情況及定量分析。（B、D）SiHa-Cripto1（-）組及SiHa-Vector組克隆形成情況及定量分析。數據使用算術均數±標準偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

3.3 Cripto-1在裸鼠成瘤模型中促進腫瘤生長

為進一步探究Cripto-1在體內的作用，我們利用裸鼠的異種移植瘤模型研究了Cripto-1對宮頸癌細胞體內增殖的影響。實驗結果表明，在飼養時間相同的條件下，注射低表達Cripto-1因子的穩轉SiHa細胞株的裸鼠皮下成瘤體積明顯低于對照組（圖6 A、C）。飼養28天后處死裸鼠，剝離瘤體并稱重，結果顯示，低表達Cripto-1組的腫瘤重量和體積顯著低于對照組，差異具有統計學意義（圖6 B、DP＜0.05）。結果提示Cripto-1因子的表達對裸鼠的皮下成瘤起促進作用。

圖6 Cripto-1的低表達抑制小鼠模型中的腫瘤生長。（A）在處死小鼠后立即拍攝圖像，上組小鼠為注射Cripto-1低表達細胞系組，而下組圖像中的小鼠為對照組。（B）腫瘤重量。（C）從裸鼠身上切除的腫瘤。（D）每周測量腫瘤體積。數據使用算術均數±標準偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

4 討論

宮頸癌起源于子宮頸，是女性較為常見的惡性腫瘤類型，其發病率與死亡率均較高，在2020年全球女性惡性腫瘤統計中，宮頸癌發病率僅次于乳腺癌，肺癌，結直腸癌，是女性癌癥發病中第四常見的疾病[10]。在全球欠發達地區，宮頸癌的發病率居女性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[11]。傳統觀點認為，大多數宮頸鱗狀細胞癌的發病與HPV感染有關，但越來越多的研究表明，部分宮頸癌患者可不伴隨HPV感染，其病理類型多為腺癌[12]。對早期宮頸癌患者，行根治性子宮切除術可提高生存率，有研究表明，對腫瘤具有高級別特征，如切緣細胞受累，淋巴結轉移，宮旁侵犯及遠處轉移的宮頸癌患者，術后使用輔助外照射放射治療同時進行鉑類化療，可提高患者的總生存期和無進展生存期。對有中等危險因素的宮頸癌患者，使用輔助外照射放射治療可減少宮頸癌患者的局部復發[13]。隨著生物化學、分子生物學技術及細胞信號轉導通路研究的進展，生物學標志物及基因靶點在癌癥的診斷、治療、預后方面逐漸開始發揮越來越重要的作用。靶向治療藥物是針對惡性腫瘤細胞明確位點而設計的藥物，特異性高，不良反應較小，作用效果好，成為多種癌癥的主流治療方案[14]。同時，宮頸癌的治療目前并沒有有效可行的治療靶點[15]。同時，放化療抗性的產生是目前臨床癌癥治療的主要障礙之一，分子靶向增敏治療也是目前對宮頸癌治療方法的研究熱點之一[16]。因此，探討并確定宮頸癌診斷，治療，預后及隨訪的特異性生物學標志物有一定必要性。

畸胎瘤衍生生長因子-1（TDGF-1），又名Cripto-1，屬于表皮生長因子/Cripto/FRL1/Cryptic（EGF-CFC）蛋白家族，定位在人類染色體3p21.3，編碼Cripto-1蛋白[17]。Cripto-1蛋白分子量為21KD，屬于膜相關蛋白，包含一個修飾的EGF樣結構域、一個富含CFC半胱氨酸的結構域、一個NH2-末端信號肽和一個短的疏水COOH-末端，該末端包含糖基磷脂酰肌醇（GPI）切割和附著的短序列[18]。在早期胚胎內胚層與中胚層的形成過程中，通過參與Nodal信號傳導的調節，參與了早期胚胎誘導過程[19]。研究顯示，除了干細胞，Cripto-1在正常人體高分化組織及小鼠正常組織中的表達水平很低[20]。在正常組織的惡性轉化過程中，Cripto-1在多種人類癌癥中重新表達，包括結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌，生殖系統惡性腫瘤如卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、前列腺癌和睪丸癌[21]。亦有研究發現，Cripto-1的過表達可能與癌前病變如胃腸上皮化生、乳腺導管原位癌的發生相關[22]。另外，在長期幽門螺桿菌感染和萎縮性胃炎（胃癌發生的兩個風險因素）的患者中，以及在屬于遺傳性結直腸癌高危人群中未發病的個體的正常腸粘膜中，Cripto-1分子亦有表達[23]。已有觀點認為，Cripto-1可能成為惡性腫瘤及癌前病變診斷治療的重要靶點。在一項對宮頸癌的研究中，Ertoy和collaborator收集臨床樣本的免疫組織化學研究結果顯示，與正常宮頸組織相比，Cripto-1在早期宮頸癌患者的組織切片中的表達量增加，該研究還表明，Cripto-1高表達量與腫瘤的高風險特征，如腫瘤大小、切緣細胞受累、淋巴結轉移、宮旁侵犯及遠處轉移相關，同時，在宮頸癌轉移的盆腔淋巴結中，亦可見Cripto-1表達水平增加[24]。另一項研究結果顯示，下調肝癌細胞HepG2中Cripto-1的表達可增加肝癌細胞中上皮間質轉化標志物的表達，且與其對Dishevelled-3的穩定和Wnt/beta-catenin通路的激活相關[25]。

在臨床腫瘤學研究中，惡性腫瘤患者的生存時間是衡量患者治療受益程度的重要標準之一，通常包括總生存時間（Overall Survival,OS）、無進展生存時間（Progression-Free Survival,PFS）和中位生存時間（Median Survival Time，MST）。總生存時間指從病人確認患有疾病開始至因任何原因引起死亡的經過的時間，通常認為總生存時間是衡量抗腫瘤治療的最佳指標。無進展生存時間通常定義為患者接受治療開始，直到疾病進展（如腫瘤復發）或因各種原因出現死亡的時間，對于很多病人生存時間普遍較長的癌癥，如宮頸癌、乳腺癌等，PFS可反映腫瘤的生長，并不受交叉治療和后續治療的影響，可作為此類惡性腫瘤的主要終點指標或次要終點指標[26]。對TCGA數據庫中278例宮頸癌患者的生存分析結果表明，Cripto-1的高表達水平對宮頸癌患者總生存時間無明顯影響，但可能導致宮頸癌患者無進展生存時間的縮短，此結果提示Cripto-1的表達可能為宮頸癌不良預后的危險因素。

為進一步探討Cripto-1在宮頸癌中的生物學作用，我們設計了一系列體內外實驗。我們在宮頸癌SiHa和HeLa細胞中進行了一系列細胞功能學實驗。增殖失控是惡性腫瘤細胞的特征性行為之一，也是評價腫瘤惡性程度的重要指標之一。細胞增殖實驗結果證明，Cripto-1基因促進了宮頸癌的細胞增殖行為，并增加了細胞的克隆能力。

我們的體外實驗結果提示，Cripto-1的下調能有效抑制宮頸癌細胞的增殖。為進一步探究Cripto-1在體內的作用，我們利用裸鼠的異種移植瘤模型研究了Cripto-1對腫瘤體內增殖的影響。實驗結果顯示，在經過相同的成瘤時間，注射低表達Cripto-1因子的穩轉SiHa細胞株的裸鼠皮下成瘤體積明顯低于對照組，且處死裸鼠并剝離瘤體稱重的結果顯示，低表達Cripto-1組的腫瘤重量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果提示Cripto-1因子的表達對裸鼠的皮下成瘤起促進作用。

5 結論

本研究結果表明，高表達Cripto-1的宮頸癌患者無進展生存時間較短，提示其與宮頸癌的不良預后有關。Cripto-1在體內外均可促進宮頸癌細胞的生長。