菟絲子中一個新的吲哚類生物堿

杜 錕，薛貴民，支燕樂，趙珍珠，司盈盈，陳 輝，馬金蓮

1河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046；2河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450000；3河南中醫藥大學中醫藥科學院，鄭州 450046

組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是第一個被發現的組蛋白去甲基化酶，2004年由施洋課題組所報道[1]。LSD1可通過黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)催化的氧化反應，能特異性去除組蛋白賴氨酸H3K4及H3K9的單甲基和雙甲基[2]，從而激活或者抑制基因的轉錄。LSD1通過改變與腫瘤增殖和轉移相關基因啟動子區域組蛋白的甲基化狀態，從而調節相關蛋白的表達，促進多種腫瘤細胞的生長和轉移[3]。目前，LSD1已被證實是一個重要的致癌驅動因素和多種腫瘤的治療靶點。研究已顯示，多種黃酮類化合物對LSD1具有較好的抑制活性，為發現新型抗腫瘤先導化合物打下基礎[4]。但是，不同的黃酮類化合物可顯示較大差異的LSD1抑制活性，和其取代基的變化密切相關[4]。

菟絲子Cuscutachinensis系旋花科(Convolvulaceae)菟絲子屬(Cuscuta)植物，為一年生寄生草本，廣泛分布于我國東北、西北以及華北等地區，其種子為中醫臨床中常用的補益中藥[5]。菟絲子味辛、甘、平，歸肝、腎、脾經，具有補益肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等功效[6]。現代藥理學研究顯示菟絲子在生殖系統調節、抗衰老、免疫調節、心腦血管保護和降血糖等方面具有顯著的藥用價值[5]。菟絲子的化學成分主要為黃酮類化合物，此外還含有木脂素類、萜類和生物堿類等化合物[7]。因此，為進一步了解中藥菟絲子的藥效物質基礎，提高其資源綜合利用效率，本文對菟絲子的甲醇部位的化學成分進行了分離純化和結構鑒定，并測試了其中黃酮類化合物的LSD1抑制活性，以期發現具有抗癌作用的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀、Bruker maxis HD型飛行時間質譜(德國Bruker公司)；Flexa型中壓制備液相色譜儀(博納艾杰爾，FL-H050G型半制備型高壓輸液泵，HP-Q-UV100型紫外檢測器，檢測波長：210 nm和254 nm；Agela technologies型色譜工作站)。LC52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030型半制備型高壓輸液泵，UV200型紫外檢測器，檢測波長：210 nm和254 nm；Easychrom型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A，250 mm × 20 mm，5 μm)。薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech公司)；RP-C18(40～60 μm，YMC)；大孔樹脂Diaion HP-20(日本三菱化學)；甲醇(色譜純，天津市四友精細化學品有限公司)；其他試劑均為分析級；HEPES緩沖溶液(北京索萊寶公司)；H3K4me2(上海吉爾生化公司)。

1.2 植物材料

菟絲子于2019年9月購自亳州市藥材市場，經河南中醫藥大學藥學院董誠明教授鑒定為旋花科植物菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子。憑證樣本(ID-20190920)存于河南中醫藥大學天然藥物化學與中藥化學研究室。

1.3 化合物的提取分離方法

菟絲子干燥種子2.67 kg，二氯甲烷和甲醇依次浸泡提取3次，濾過，合并提取液，減壓濃縮，分別得到二氯甲烷浸膏171 g和甲醇浸膏60 g。甲醇浸膏加水混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部位(11 g)、正丁醇部位(18 g)。乙酸乙酯部位經Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化(甲醇)，并經硅膠薄層色譜檢識，合并相同流分得到16個組分(Fr.A1～A16)。Fr.A6經硅膠柱色譜分離(二氯甲烷-甲醇5∶1)，得到組分5個亞流分(Fr.A6-1～A6-5)。Fr.A6-1 經制備型HPLC制備(45%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物6(3.0 mg，tR= 7.9 min)。Fr.A14 經制備型HPLC制備(65%甲醇，體積流量 3 mL/min)得到化合物4(2.5 mg，tR= 10.0 min)、5(6.6 mg，tR= 16.5 min)。正丁醇部位經Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化(甲醇)，并經硅膠薄層色譜檢識，合并相同流分得到 15個組分(Fr.B1～B15)。Fr.B2(2 g)經硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(25∶1、15∶1、10∶1)洗脫，得到組分5個亞流分(Fr.B2-1～B2-5)。Fr.B2-3 經制備型HPLC制備(20%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物1(3.0 mg，tR= 13.5 min)。Fr.B7(1.5 g)經硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(25∶1、15∶1、10∶1)洗脫，得到組分5個亞流分(Fr.B7-1～B7-5)。Fr.B7-3 經制備型HPLC制備(55%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物2(7.5 mg，tR= 8.0 min)。Fr.B7-5 經制備型HPLC制備(55%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物3(3.0 mg，tR= 9.0 min)。

1.4 LSD1抑制活性試驗

利用純化好的LSD1重組蛋白，在96孔黑孔板中每孔先加入LSD1重組蛋白與不同濃度的化合物在HEPES緩沖溶液中室溫孵育，后加入反應底物H3K4me2溶液于37 ℃恒溫搖床孵育；分別加入Amplex Red溶液，辣根過氧化酶溶液反應顯色。最后用熒光酶標儀檢測熒光強度。每板同時設定空白對照孔與100%對照孔。空白孔中的樣品與H3K4me2分別用DMSO與緩沖溶液替代，100%孔中的樣品用1.25 μL的DMSO替代。ORY-1001作為陽性對照化合物。酶活實驗重復3次，使用SPSS20和GraphPad 7.0進行數據分析。

2 實驗結果

2.1 化合物結構鑒定

化合物1淡黃色油狀物，易溶于甲醇；ESI-HR-MS譜給出準分子離子峰m/z241.097 3[M+H]+(calcd for C14H13O2N2，241.097 2)，確定化合物1的分子式為C14H12O2N2，計算其不飽和度為10。1H NMR譜(表1)中，低場區顯示有1組1，2-二取代的芳香質子信號[δH8.18(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.20(1H，dd，J= 8.5，8.0 Hz，H-10)，7.50(1H，dd，J= 8.5，8.0 Hz，H-11)，7.58(1H，d，J= 8.0 Hz，H-12)]，2個烯烴質子信號[δH8.20(1H，d，J= 5.2 Hz，H-5)和7.91(1H，d，J= 5.2 Hz，H-6)]，1個活潑質子信號[12.0(1H，br s，N-H)]；高場區顯示1個亞甲基質子信號δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)。另外，結合1H-1H COSY譜中的δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)，3.32(2H，overlap，H-14)自旋偶合系統和δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)的偶合常數，提示結構中還有1個與溶劑峰重疊的亞甲基質子信號3.32(2H，overlap，H-14)；13C NMR及DEPT譜中顯示了10個芳香碳或雙鍵碳(6個次甲基碳δC137.2、127.6、121.5、119.0、112.6、112.0和4個季碳δC140.4、134.2、126.9、121.0)。通過分析HSQC譜中相關(H-15/δC33.7，H-14/δC29.4)和HMBC譜中遠程相關(H-14/δC176.3和H-14，H-5/δC145.8)，提示該結構在13C NMR譜中未出現的兩個亞甲基碳(δC33.7、29.4)、一個季碳(δC145.8)和一個羰基碳(δC176.3)信號。通過對以上數據和文獻對比分析，推測化合物1為一個β-卡波林類生物堿[8]。結合1H-1H COSY圖譜中顯示的三個自旋偶合系統(H-9/H-10/H-11/H-12，H-5/H-6和H-14/H-15)(見圖1)，和HMBC圖譜中的關鍵遠程相關(H-14/C-2，C-3，C-16；H-5/C-3，C-7；H-6/C-2，C-8和H-9/C-7，C-13)，化合物1鑒定為如圖2所示的結構，命名為菟絲子新堿A(cuscutalin A，1)，是一個新化合物。化合物1的ECD譜沒有Cotton效應，同時，經IC手性色譜柱無法拆分，因此未確定C-3的絕對構型。化合物1的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數據(500和125 MHz，DMSO-d6)

圖1 化合物1的關鍵1H-1H COSY和HMBC相關

圖2 化合物1的結構

化合物2淡黃色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z463[M-H]-。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.62(1H，s，5-OH)，7.66(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′)，7.52(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.81(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.19(1H，s，H-6)，5.37(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，3.14～3.70(6H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′，6′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.3(C-2)，133.4(C-3)，177.4(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-9)，103.8(C-10)，121.1(C-1′)，115.1(C-2′)，144.8(C-3′)，148.5(C-4′)，115.9(C-5′)，122.0(C-6′)，101.8(C-1′′)，71.2(C-2′′)，73.2(C-3′′)，67.9(C-4′′)，75.8(C-5′′)，60.1(C-6′′)。以上數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物2為金絲桃苷。

化合物3淡黃色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z597[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.73(1H，s，5-OH)，7.78(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，7.49(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，6.79(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.38(1H，s，H-8)，6.18(1H，s，H-6)，5.58(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，5.31(1H，d，J= 1.0 Hz，H-1′′′)，3.03～3.85(11H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′，6′′，2′′′，4′′′，5′′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.2(C-2)，133.2(C-3)，177.3(C-4)，161.3(C-5)，98.6(C-6)，164.1(C-7)，93.4(C-8)，155.6(C-9)，103.9(C-10)，121.1(C-1′)，115.5(C-2′)，144.9(C-3′)，148.4(C-4′)，115.2(C-5′)，122.4(C-6′)，98.9(C-1′′)，74.7(C-2′′)，73.8(C-3′′)，68.3(C-4′′)，75.7(C-5′′)，60.0(C-6′′)，108.7(C-1′′′)，76.1(C-2′′′)，79.2(C-3′′′)，73.9(C-4′′′)，64.3(C-5′′′)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物3為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-(2→1)-β-D-芹糖苷。

化合物4淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇;ESI-MS：m/z303[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，5-OH)，7.67(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.53(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，d，J= 1.5 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J= 1.5 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.6(C-2)，136.7(C-3)，176.6(C-4)，162.4(C-5)，98.5(C-6)，164.6(C-7)，94.2(C-8)，156.8(C-9)，104.2(C-10)，122.6(C-1′)，115.5(C-2′)，145.7(C-3′)，147.2(C-4′)，116.1(C-5′)，120.8(C-6′)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物4為槲皮素。

化合物5淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇;ESI-MS：m/z287[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，5-OH)，8.05(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.15(1H，s，H-6)，6.40(1H，s，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：146.7(C-2)，135.4(C-3)，175.8(C-4)，160.8(C-5)，98.3(C-6)，163.6(C-7)，93.6(C-8)，156.4(C-9)，103.2(C-10)，121.4(C-1′)，129.3(C-2′，6′)，115.1(C-3′，5′)，159.2(C-4′)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物5為山奈酚。

化合物6無色針狀結晶(MeOH)，溶于甲醇;ESI-MS：m/z377[M + Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.92(2H，d，J= 1.2 Hz，H-2，2′)，6.86(2H，d，J= 8.0 Hz，H-5，5′)，6.83(2H，d，J= 8.0，1.2 Hz，H-6，6′)，5.99(4H，s，2 x OCH2O)，4.64(2H，d，J= 4.1 Hz，H-7，7′)，4.11(2H，dd，J= 9.0，6.8 Hz，H-9a，9′a)，3.75(2H，dd，J= 9.0，3.4 Hz，H-9b，9′b)，2.99(2H，m，H-8，8′)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物6為芝麻素。

2.2 LSD1抑制活性結果

對分離量較大的兩個化合物2和5進行了LSD1抑制活性評價，分別設濃度(C)50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μmol/L，ORY-1001濃度設100 nmol/L。結果表明，化合物2和5對LSD1顯示出較強的抑制作用，半數抑制濃度(IC50)分別為5.74 ± 0.49和3.94 ± 0.27 μmol/L(見圖3)，ORY-1001的抑制率為69%。

圖3 化合物2和5的LSD1抑制活性

3 討論與結論

本文從菟絲子的甲醇提取物中共分離得到6個單體化合物。其中化合物1是一個消旋體，為一個新的β-卡波林類生物堿，化合物2～5為黃酮類化合物，化合物6為一個木脂素類化合物。菟絲子總黃酮具有較好的體內外抗肝腫瘤活性，但其有效成分與作用機制尚未明確[14]。同時，菟絲子的LSD1抑制活性也尚未報道。本文首次對菟絲子中黃酮類化合物2和5進行了LSD1抑制活性評價，結果顯示兩個化合物均對LSD1具有較強的抑制作用，為完善黃酮類化合物LSD1抑制活性的構效關系研究打下基礎。另外，菟絲子中富含黃酮類化合物，但其中生物堿類成分報道較少，本文進一步豐富了中藥菟絲子中生物堿的種類，并為探究其藥效物質基礎和更好地開發利用菟絲子藥材奠定了一定的理論基礎。