藥物-基因組學與哮喘個體化診療的研究

朱予津 高維 韓國敬 胡紅

哮喘是一種異質性疾病，受遺傳和環境因素的影響[1]。哮喘具有多種表型(Phenotypes)[2]。表型是指生物體基因與環境共同作用后被觀察到的特征[3]。近年來哮喘的表型不斷細化[4]，進而指導個體化治療[5]。有時表型仍無法解釋患者對藥物的反應差異問題[6]。有學者認為，高達80%的哮喘患者對藥物的反應差異是由遺傳變異引起[7]。單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)與患者哮喘的病情嚴重程度和易感性相關[8-11]。SNP也與藥物療效相關[12-13]。該領域的研究有助于揭示患者藥物反應差異的遺傳學特征，更好地指導個體化治療[14]。本研究選擇了目前研究相對成熟的9個影響哮喘藥物療效的相關基因SNP位點(見表1)進行研究，探索其在哮喘個體化診療中的價值。

資料與方法

一、研究對象

選擇2017年1月1日～2019年4月1日于解放軍總醫院就診的哮喘患者，共納入患者98例(涵蓋兩種表型，其中嗜酸性粒細胞型哮喘患者90例，中性粒細胞型哮喘患者8例)；選擇542例健康人作為正常對照組。本研究已報備醫院倫理委員會并批準(S2016-089-01)。

入組標準：年齡16～70歲，男女不限，行動不受限，能正確表達思想，未參加其它臨床試驗；嗜酸性粒細胞型哮喘標準：誘導痰Eos≥3%且Neu≤61%；呼出氣一氧化氮(Fractional exhaled Nitric Oxide, FeNO)>25 ppb；中性粒細胞型哮喘標準：誘導痰Eos<3%且Neu>61%；排除標準：年齡未滿16歲或超過70歲；近1個月內有呼吸道感染史；慢性肺部疾病、心腦血管疾病及腫瘤患者等；無法完成肺功能及誘導痰檢查者；處于妊娠期或哺乳期患者；選取健康對照組542人,入組標準(該組人群由諾禾致源測序公司提供)：年齡16～70歲，男女不限；無慢性呼吸道疾病及哮喘、過敏性疾病，無腫瘤及心腦血管等慢性疾病史。

二、方法

采集哮喘患者臨床信息：家族及個人過敏史、血常規、過敏原、總IgE、誘導痰、肺功能、FeNO、哮喘控制測試(ACT)評分、哮喘控制問卷(ACQ)等；靜脈采取外周血1mL，使用TANGEN生物公司的DNA提取試劑盒(DP348)提取外周血DNA；選擇與哮喘藥物藥療效相關的9個基因的10 個SNP位點， ADRB2 rs1042713 A/G，FCER2 rs28364072 A/G， NR3C1 rs41423247 G/C，GLCCI1 rs37973 A/G， CRHR1 rs242941 C/A，CRHR1 rs1876828 C/T，ORMDL3 rs2872507 G/A，PDGFD rs591118 G/A，LTA4H rs2660845 A/G， CYP3A4 rs35599367 G/A進行引物設計； 利用Sequenom MassARRAY AssayDesign 3. 1 軟件設計針對這10個位點的多重PCR特異性擴增引物和延伸引物(序列見表1)。利用MassARRAY檢測突變位點；利用Sanger測序對質譜信息進行驗證。

三、統計學方法

利用病例-對照實驗進行差異 SNP篩選；統計學分析采用SPSS16.0統計軟件；卡方檢驗用于定性資料的分析，組間基因型分布以及基因型組合的比較采用卡方檢驗；對于符合正態分布的數據采用均數±標準差(Mean±SD)，兩組間采用獨立樣本t檢驗進行統計；如不符合正態分布，使用非參數檢驗；三組間比較用單因素方差分析；P<0.05為有統計學意義。

結 果

一、哮喘組和正常對照組資料比較

本次研究納入哮喘患者98例，其中嗜酸性粒細胞型哮喘90例，中性粒細胞型8例，全體患者中男性46例，女性52例；正常對照組542例，其中男性261例，女性281例，哮喘組與正常對照組性別構成無統計學差異；與中性粒細胞型哮喘患者相比，嗜酸性粒細胞型哮喘組FeNO、誘導痰中Eos%、哮喘家族史比例及過敏史比例更高(P<0.05)，基本特征(見表2)。

表2 哮喘患者與正常對照組基本特征

二、檢出情況

98 例哮喘患者10個SNP位點的總判讀成功率大于90%，其中最高100%，最低90.8%，符合MassARRAY檢驗交付標準； 98例哮喘患者中，按照檢出純合子風險基因為陽性標準，該研究共檢出58例陽性患者(占比59.2%)攜帶純合子突變型基因96個，其中ADRB2 rs1042713 AA型28例(31.5%)，FCER2 rs28364072 GG型9例(10.1%)，NR3C1 rs41423247 CC型1 例(1%)，GLCCI1 rs37973 GG型 23 例(25.6%)，ORMDL3 rs2872507 AA型10例(11.1%)，PDGFD rs591118 AA型2例(2.2%)， LTA4H rs2660845 AA型23例(25.6%)。

三、病例對照研究結果

哮喘患者CRHR1 rs1876828位點TC型基因發生頻次顯著高于對照組(P<0.05)，T型等位基因的發生頻次顯著高于對照組(P<0.05)，由于CRHR1 rs1876828 A>G突變病例數少，后續未進行變異與臨床特征相關性分析； FCER2 rs28364072位點AA型基因發生頻次顯著低于對照組(P<0.05)，A型等位基因的發生頻次顯著低于對照組(P<0.05)；余位點各基因型及等位基因頻次比較無顯著差異。具體基因型分布(見表3)。

表3 各SNP位點在哮喘組和對照組間的基因型分布情況

四、哮喘患者FCER2 rs28364072 A>G突變與患者臨床特征及生物標志物相關性分析

本研究檢測出FCER2 rs28364072分型哮喘患者90例，其中AA型患者1例， AG型患者79例，GG型患者9例。 與等位基因為AA+AG的患者比較，等位基因為GG型的患者哮喘未控制比例、重癥哮喘比例更高(P<0.05) ； GG型較AA+AG型FeNO 更低(P<0.05)；其它臨床特征及生物標志物等無統計學差異(見表4、5)。

表4 FCER2 rs28364072 A>G突變與89例患者臨床特征相關性分析

表5 FCER2 rs28364072 A>G突變與89例患者臨床特征相關性分析

五、10個SNP組合對于患者用藥風險基因檢出的陽性率

本研究聯合9個基因10個SNP分析，按照純合子風險基因為陽性標準，該組合共檢出58例陽性患者，陽性率為59.2%。

六、個體化診療實踐探索

舉例1：患者李XX 主訴：咳嗽伴胸悶氣短8年，加重3天，既往規律使用丙酸氟替卡松/沙美特羅500ug 2/日+孟魯司特鈉治療，ACT 12分，為“重癥哮喘”患者。化驗：血常規陰性；過敏原：花粉，花生，油煙，中草藥；IgE：666 U/L；肺功能：FEV135.8%，FEV1/FVC 36.1% ，PEF 33.2%，BDR(-)，FeNO 30ppb。結合其基因檢測結果(見表6)，患者rs1042713為AA顯示使用β2受體激動劑受益降低，但可能使用噻托溴銨有獲益，鑒于患者與ICS相關位點也無優勢基因型，我們在原有治療基礎上加用了噻托溴銨粉吸入劑 18ug 吸入 1噴/日，并給予奧馬珠單抗375mg 1/2周，持續3個月，規律用藥半年余后復查： ACT 20分，肺功能： FEV142.7%，FEV1/FVC 45.3% PEF 48%，BDR(-)， FeNO 25ppb。而后調整丙酸氟替卡松/沙美特羅為250ug 2噴/日+噻托溴銨粉吸入劑 18ug吸入 1噴/日，3個月后患者復查肺功能較前相仿，癥狀控制可。

表6 患者李XX基因檢測結果

舉例2：患者任XX 主訴：咳嗽、胸悶5年，加重1周，既往間斷使用布地奈德/福莫特羅160ug 2噴/日，ACT16分。化驗：血常規陰性；誘導痰：Neu66%，Eos0%；過敏原：無；IgE:42U/L；肺功能：FEV155.8%，FEV1/FVC 49.4%， PEF 43.5%，BDR(-)，FeNO 22ppb。患者基因檢測結果(見表7)顯示rs1042713為AA型，預示使用β2受體激動劑受益可能降低，使用ICS可能受益，我們停用了布地奈德/福莫特羅，使用地奈德吸入劑200ug 2噴/日，加用思力華能倍樂噴霧劑 5ug吸入 1噴/日，由于患者為中性粒細胞型哮喘，結合文獻報道使用阿奇霉素治療可能獲益，我們加用了阿奇霉素膠囊0.25g 1粒/日，規律用藥半年余后復查： ACT 21分，肺功能： FEV182.7%，FEV1/FVC 60.3%， PEF 75%，BDR(-) ，癥狀較前明顯好轉。

表7 患者任XX基因檢測結果

討 論

一、SNP檢測在哮喘研究中占有重要地位

支氣管哮喘作為異質性疾病具有明顯遺傳傾向，文獻中報道，超過1000個基因與哮喘相關[15-16]。哮喘的發病機制復雜，可分為遺傳學機制、炎癥機制、免疫機制等[17]。SNP研究在基因遺傳學機制研究中占有重要地位，全基因組關聯分析研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)對于識別、驗證哮喘易感基因的SNP具有重要作用[18-19]。根據基因SNP所在位置分為編碼區和調控區。作為調控區重要組成部分的啟動子就像“開關”一樣精準控制著基因的轉錄翻譯，位于啟動子區的SNP可以導致基因轉錄障礙，而位于外顯子(編碼區)的SNP則可影響氨基酸合成，間接影響蛋白質功能，而內含子區的SNP可能參與到連鎖平衡機制[20]。

二、哮喘藥物療效與SNP的關系

藥物-基因組學研究可以識別出具有風險基因型的患者，這為哮喘患者可能的用藥療效和副作用提供了科學依據[21]。本研究結合既往文獻報道，選擇了臨床研究相對成熟的幾個與藥物療效相關的SNP位點進行研究，對98 名哮喘患者進行了MassARRAY 質譜分析，利用藥物基因組學提供的基因型信息，對部分患者給予了個體化治療的指導。

1 β2腎上腺素能受體激動劑

β2腎上腺素能受體(β2 Adrenoceptors，ADRB2)rs1042713 G>A。 ADRB2 位于染色體5q31-32。ADRB2 作為鳥苷酸結合蛋白偶聯受體(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)成員在支氣管上皮、黏膜下腺、細支氣管平滑肌、肺動脈平滑肌、肺動脈內皮細胞和肺泡壁中均有表達。研究發現rs1042713基因型與哮喘未來加重風險相關[22]。 rs1042713位于基因啟動子區，G>A變異(16，Gly-to-Arg)與基因表達相關[23]，且多項研究證實該變異與SABA治療后肺功能峰流速變化相關[13, 24]。同GG基因型相比，攜帶AA基因型的哮喘患兒對沙丁胺醇或沙美特羅應答較低，使用長效β2受體激動藥可增加哮喘惡化的風險[25-26]。一項研究利用計算機輔助設計模擬了rs1042713不同變異體與藥物的結合程度，從而在機制上解釋了不同變異體對于SABA藥物反應的差異[27]。研究表明，與沙美特羅+吸入性氟替卡松治療組比較，孟魯司特鈉+吸入性氟替卡松治療組的AA基因型難治性哮喘患兒的哮喘控制更佳，肺功能改善更好[25]。另有研究認為，ADRB2 可預測抗膽堿能藥物(噻托溴銨)的應答情況，在AA型應答率為61.9%，GA 、GG 基因型的應答率為25.4%[28]。目前，國內學者已有根據ADRB2基因分型進行用藥指導的研究，對于β2受體激動劑應答效能低的患者可嘗試使用抗膽堿能藥物[29]。本研究中發現患者組AA純合子的有28人，占總人群31.5%，預示著這些患者可能從β2受體激動劑治療中獲益降低。

2 糖皮質激素

(1)IgE受體Fc片段(Fc fragment of IgE receptor Ⅱ ，FCER2) rs28364072 A>G 。FCER2位于染色體19p13.2，負責編碼IgE 受體(CD23)，通過影響B淋巴細胞周期影響IgE水平[30]。該位點接近外顯子區域，可能通過剪切變異影響FCER2基因的表達，IgE受體(CD23)在C(hg37中為G)等位基因攜帶者中為低表達，受體激活后IgE水平升高。rs28364072不同基因型與ICS治療后患者的IgE水平、哮喘急性發作率、FCER2表達有關[31]。有學者比較了該位點的三種基因型與FENO水平的相關性，結論顯示不同基因型哮喘患者中FENO差異顯著，AA型最高，GG型最低[32-33]。臨床中高FENO水平預示著對ICS反應良好，因此，對ICS的反應GG型較差[34]。本研究中發現兩組人群三種基因型頻率具有統計學差異，哮喘組AA型基因發生頻次顯著低于健康對照組，本研究發現，攜帶GG基因患者共9例，占患者檢出總數10.1%，預示著這些患者可能使用糖皮質激素的受益降低。在基因型與患者臨床特征及生物標志物相關性分析中我們發現，GG型的患者哮喘未控制比例、重癥比例更高(P<0.05) ；GG型較AA+AG型FeNO 更低，與既往文獻報道一致，預示著rs28364072基因檢測對臨床診斷及用藥具有參考價值。

(2)核受體亞型3，C組成員1 (Nuclear Receptor subfamily3,group C, member 1, NR3C1) rs41423247 G>C 。 NR3C1 編碼糖皮質激素受體(Glucocorticoid Receptor, GR)，位于染色體5q31.3，不同基因型與哮喘患者吸入糖皮質激素治療后肺功能的改善相關[35]。有研究顯示糖皮質激素抵抗可能與NR3C1 基因型相關[36]，不同基因型可導致基因轉錄活性以及蛋白表達產物活性的降低，間接影響ICS 的使用效果[37]。研究表明，哮喘患者使用高劑量的丙酸氟替卡松治療后4 h，CC、CG 型FEV1%、血氧飽合度的改善比GG 型低，且哮喘人群中G 等位基因的分布頻率高于正常人群[38]。本研究中發現患者組中CC型1人，GC型29人，該部分患者對吸入性糖皮質激素的效果可能弱于GG型。本研究哮喘患者中GG型分布同樣高于健康對照組，但無統計學意義。

(3)糖皮質激素誘導轉錄蛋白1(Glucocorticoid Induced 1，GLCCI1)rs37973 A>G。GLCCI1基因位于染色體7q21.3，是一種蛋白質編碼基因，ICS 可誘導該基因表達增加[39]。我國學者的研究證實rs37973基因型與糖皮質激素療效及肺功能相關[40-42]。國外研究認為，攜帶GG型哮喘患者糖皮質激素反應差， GA 基因型居中，而AA型較好[43-44]。我國學者研究發現，布地奈德氣霧劑對AA型患者更為理想、不良反應發生率低，而G等位基因則相對較差，該結論給哮喘控制較差的患者個體化給藥治療提供了參考依據[45]。本研究中發現患者組GG純合子23人，占總患者25.6%，預示著這些患者糖皮質激素的治療受益可能會降低。

(4)促腎上腺皮質素釋放激素受體1 (Corticotropin Releasing Hormone Receptor 1，CRHR1)rs242941G>T及rs1876828 A>G。CRHR1基因位于染色體17q21.31，負責編碼G蛋白耦聯受體，對于激活影響下丘腦-垂體-腎上腺通路的信號轉導通路至關重要。該基因參與內源性糖皮質激素的產生且會增加變應原誘導的氣道炎癥反應，可能會影響外源性糖皮質激素的療效。藥物基因組學研究發現CRHR1基因內含子上2個位點rs242941G/T(hg37中為C/A)及rs1876828 A/G(hg37中為C/T)與ICS 治療8 周后的FEV1變化有關，rs242941 TT型吸入糖皮質激素效果是野生型的2倍，而rs1876828 AA(在hg37中為TT)型吸入糖皮質激素效果是野生型的4倍[46]。有學者使用貝葉斯高斯模型將兩個SNP rs242941 和rs1876828 組合成FEV1變化的預測模型，發現兩個SNP組合預測模型比單一突變有更高的準確性和可復制性，是預測激素療效的生物標志物[47]。本研究中rs242941兩組人群基因型頻率無統計學差異，所有患者均未攜帶AA優勢性突變，預示著本研究所有患者失去了吸入性糖皮質激素治療的先天優勢；而rs1876828兩組人群基因型頻率具有統計學差異，未發現TT型優勢性突變，但三例患者為TC型，可能從糖皮質激素治療中獲益更大。由于針對該突變患者病例較少，未能做基因分型與臨床及生物標志物的相關性分析。

(5)神經鞘脂類蛋白3(ORMDL Sphingolipid Biosynthesis Regulator 3，ORMDL3)rs2872507A>G。 ORMDL3基因是哮喘的易感基因，它位于染色體17q21.1，可影響鞘磷脂的合成參與內質網介導的鈣離子通路。研究顯示，ORMDL3 rs2872507基因型與基因表達相關，歐洲一項研究顯示，rs2872507與糖皮質激素效果治療后的肺功能變化相關，AA 型使用ICS效果最優[48]。本研究發現攜帶AA基因患者共10例，占患者檢出總數11.1%，預示著這些患者從吸入性糖皮質激素治療獲益的可能性更高。

(6)血小板源性生長因子(Platete-Derived Growth Factor D，PDGFD)rs591118 G>A。PDGFD位于染色體11q22.3，由于哮喘患者面臨吸入性糖皮質激素和全身性糖皮質激素的使用，因此需關注患者的腎上腺功能抑制風險。據報道，規律吸入200mg/日的倍氯米松可誘導腎上腺功能出現抑制，1/3的哮喘患者使用激素后皮質醇峰濃度小于542 nmol /L[49]。除了哮喘，COPD患者使用ICS治療也可能出現腎上腺功能抑制[50]。瑞典一項關于兒童和成人口服糖皮質激素的研究發現，口服潑尼松龍≥5 mg/日，21天即有腎上腺皮質功能不全的風險，據研究使用激素出現腎上腺皮質抑制的時間分別為1天到4周不等[51]。在一項隊列研究中發現PDGFD基因內含子區SNP rs591118 G>A與腎上腺功能抑制相關，這一發現在兒童哮喘和成人COPD患者中均得到了驗證，腎上腺抑制患者比例為GG型最低，AG型居中，而AA型最高[52]。本研究發現攜帶A A基因患者2例，占患者檢出總數2.2%，預示著該兩名患者未來腎上腺皮質抑制的可能性更高。

3 白三烯調節劑

白三烯A-4水解酶(Leukotriene A-4 Hydrolase，LTA4H)rs2660845 G>A。LTA4H 位于染色體12q23.1，可水解白三烯類藥物。孟魯司特鈉是一種白三烯D4受體拮抗劑。研究顯示，LTA4H rs2660845 AG和GG 型哮喘急性發作的概率較AA 型純合子高4～4.5倍[53]。日本一項研究顯示該SNP位點與使用孟魯司特鈉后FEV1% 和PEF%變化的相關，A A型肺功能改善高于G 等位基因攜帶者(A G + G G)[54]。本研究中發現攜帶AA基因患者共23例，占患者檢出總數25.6%，預示著這些患者從白三烯類藥物的獲益較高。

4 藥物-基因組學與藥代動力學

藥物代謝酶相關細胞色素P450家族3亞家族A成員4(Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4，CYP3A4) rs35599367，C>T 。CYP3A4位于染色體7q22.1，是諸多肝臟中藥物代謝酶的一種，可代謝多種藥物。有研究分析了接受FP治療的268例哮喘患者，對藥物代謝酶CYP3A4、CYP3A7、CYP3A5中的9個SNP進行研究得出CYP3A4內含子突變rs35599367 C>T突變(hg37中為G>A)患者即CYP3A4*22攜帶者在哮喘控制方面較未突變者改善顯著，但該受益等位基因的人群攜帶率較低，約占7%[55]。這種機制可能是變異與肝臟CYP3A4mRNA表達及酶活性的下降有關，導致活性FP長時間停留氣道加強了藥效，但這種影響依賴于吸入到循環中的藥物總量[56]。本研究未發現攜帶AA基因型的患者，預示著所有患者失去了從該位點變異中的獲益。

三、聯合檢測哮喘藥物療效相關SNP位點的可行性與迫切性

2013年發表于《柳葉刀·呼吸醫學》上的一項研究通過對1000余人近40年的追蹤隨訪，發現了多個基因位點組合可預測哮喘的發生、加重以及肺功能損害程度[57]。我們試圖探索尋找出評估哮喘藥物治療效果的一組SNP位點組合，為哮喘患者，尤其是重癥哮喘患者提供用藥依據。目前已有地區根據藥物基因組學的研究將個體化的治療列入了哮喘治療指南并應用于臨床[58]，但國內外尚無聯合SNP位點用于評估多種哮喘藥物療效的基因組合，本研究有助于為哮喘患者尤其是重癥哮喘患者的藥物個體化治療提供幫助。文中僅通過兩個例子說明了個體化治療對治療控制不佳的患者的可行性，通過結合患者基因分型，指導用藥的實踐，很多患者的疾病得到了較好的控制。未來期望藥物-基因組學的研究加快理論向臨床實踐轉化的步伐，以提高其預測評估藥物治療反應的準確性，讓更多的哮喘患者從基因檢測中獲益。