硫氧化菌篩選及生物氧化特征研究

于淑豪，翟中葳，沈豐菊，梁軍鋒*，張克強*，李明堂，王銳

（1.吉林農業大學資源與環境學院，長春 130118；2.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；3.咸寧市咸安區農業環境保護站，湖北 咸寧 437000）

我國是畜禽養殖大國，據報道2020年我國生豬、牛、羊出欄量分別為52 704萬、4 565萬、31 941萬頭，養殖當量居世界首位[1-3]。如此龐大的畜禽養殖規模，引發了一系列的環境問題，其中惡臭氣體是養殖場的主要污染物之一，嚴重影響場區周邊空氣質量。據2021年生態環境部統計[4]，2020年全年畜牧業惡臭投訴占全部惡臭/異味投訴的比例為12.7%，居所有被投訴行業首位。這些惡臭氣體排放不僅對畜禽本身的生長有影響，而且對周邊環境及人類健康也是一種危害，因此畜禽養殖產生的惡臭問題，已經成為急需解決的問題。

畜禽養殖場的惡臭氣體源自畜禽養殖與糞污處理過程，如動物呼吸、動物糞尿、廢水處理及糞便處理等[5]。畜禽養殖所帶來的惡臭成分復雜多樣，按照其成分可以歸為：氨和揮發性胺類、吲哚和酚類、含硫化合物、揮發性脂肪酸等[6]，其中硫化氫因其嗅閾值低、排放量大而受到廣泛關注[7]。TRABUE等[8]研究發現硫化氫是豬糞貯存過程中排放的主要致臭氣體，占比在65%以上；沈玉君等[9]的研究表明硫化氫是豬糞好氧發酵過程中的主要致臭因子，因此畜禽養殖場硫化氫去除是惡臭污染治理的關鍵因素之一。

目前針對養殖場硫化氫的去除技術主要有物理法、化學法、生物法等[10-12]，其中生物法因成本低、無二次污染、設備簡單等而逐漸成為治理惡臭的主要方法[13]。葉芬霞等[14]從養殖場土壤中篩選出3株除臭菌株，復配制成菌劑后噴灑于糞污表面，可降低65%的硫化氫排放。CHEN等[15]從堆肥樣品中篩選得到一株細菌，可降低堆肥過程中35.4%的硫化氫排放。生物除臭中應用于硫化氫惡臭氣體去除的微生物主要為硫氧化菌（Sulfur-oxidizing bacteria，SOB）。目前的研究多集中在自養菌中，但自養菌普遍生長緩慢、硫氧化性能弱，這使其在實際應用中受到一定限制。異養型硫氧化菌在自然界中分布廣泛、數量繁多，已在多種生境中發現異養硫氧化菌的存在，如礦區、濕地、湖泊、土壤、海洋等[16-17]，同時異養菌生長速度快、抗干擾性強，具備更高的硫氧化能力[18-19]。如徐桂芹等[20]篩選得到12株硫氧化菌，并對其中5株自養菌、5株異養菌進行脫臭性能研究，結果表明異養硫氧化菌的硫氧化速率高于自養菌株；梁美聲等[21]篩選得到6株異養硫氧化菌及1株自養硫氧化菌，并以硫化物為底物研究其脫硫效率，結果表明異養菌對硫化物的去除效率優于自養菌。GAO等[22]的研究發現在生物反應器中接種假單胞菌可以快速啟動硫氧化反應，且該菌可以耐受較高的硫化物濃度，并保持較高的元素硫生成速率。本研究旨在篩選出一種對硫化氫具有高效降解能力且環境適應性強的異養菌株，通過生物強化技術控制糞污惡臭污染，為畜禽惡臭去除技術研發提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

樣品采集于天津市神馳牧場污水貯存池，樣品混勻后用500 mL無菌聚乙烯瓶收集，放置冰袋中保藏并運送回實驗室。

1.1.2 培養基

富集培養基為丁二酸鈉培養基[23]，其組分為C4H4Na2O410 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、MgCl20.2 g·L-1、NH4Cl 0.6 g·L-1、NaHCO33 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、Na2S·9H2O 0.8 g·L-1，pH 9.5，用去離子水溶解并定容至1 L。分離培養基為丁二酸鈉瓊脂培養基，其基礎成分同富集培養基，另按20 g·L-1比例添加瓊脂。Na2S·9H2O添加方法：取適量Na2S·9H2O溶于少量無菌水中，用無菌注射器吸取溶液，并用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌后，緩慢加入到經高壓蒸汽滅菌后冷卻至50℃的培養基中。擴繁培養基為營養肉湯培養基，pH 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 高效硫氧化菌篩選

1.2.1.1 菌株的分離鑒定及硫氧化能力測試

菌株的分離：取樣本在富集培養基中經多次稀釋富集后，在分離平板上劃線分離優勢菌屬并作斜管保存。

菌株的16S rRNA測序鑒定：取足量菌液在4℃和8 000 r·min-1條件下離心，并用無菌水清洗3次以獲得測序菌體。利用DNA提取試劑盒提取菌株基因組作為模板，采用細菌通用引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和R1492（GGTTACCTTGTTACGACTT）進行擴增反應。擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，通過NCBI數據庫對測序結果進行序列比對，在MEGA 7.0軟件中運用鄰接法（Neighbor-Joining Method）構建系統進化發育樹，進化樹拓撲結構經過1 000次引導重復取樣檢驗。

菌株的硫（S2-）氧化能力測試：取活化后的菌液用無菌水調整Optical density（OD600）值為1.0，按5%接種量接種至富集培養基中，于30℃、150 r·min-1、自然pH條件下搖床培養120 h，對照組不添加菌液，每處理組3個重復。培養0、2、4、8、12、18、24、48、72、96、120 h時從三角瓶中取樣測定反應液中的S2-與SO2-4濃度。

生長曲線測定：取活化后的菌液用無菌水調整OD600值為1.0，按5%接種量接種至富集培養基中，于30℃、150 r·min-1、自然pH條件下搖床培養120 h，每2 h進行一次取樣，取樣間隔隨培養時間適當延長，測定菌液的OD600值，以此表征菌株的生長情況。

1.2.1.2 菌株對糞污中硫化氫氣體的減排效果

從天津市神馳牧場污水貯存池中采集污水樣品進行試驗，樣品基本理化性質為：pH 6.8、干物質含量3.8%、總氮含量1 193.8 mg·L-1、總磷含量156.05 mg·L-1。硫化氫和氨氣排放測試裝置為可密封玻璃容器，容積為2.5 L，裝置示意圖見圖1。試驗方法參照張生偉等[24-26]的研究，具體如下：取800 mL污水樣品于裝置內，將菌液按1%的接種量接種，攪拌均勻后分別放入含有20 mL硼酸及鋅銨絡鹽溶液的50 mL燒杯中吸收氨氣及硫化氫，每處理組3個重復。將上述裝置放在恒溫培養箱中30℃培養3 d后測定吸收液中氨氣及硫化氫的含量。

圖1 裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of the device

1.2.2 不同因素對菌株S2-氧化特征的影響

設置單因素試驗分別測定菌株在不同接種量、溫度、轉速、初始pH條件下2 h時的OD600及S2-去除效果。接種量試驗中培養條件為溫度30℃、轉速150 r·min-1、初始pH自然（9.5），接種量設為1%、2%、4%、6%、10%；溫度試驗中培養條件為接種量4%、轉速150 r·min-1、初始pH自然（9.5），溫度設為15、20、25、30、35、40℃；轉速試驗中培養條件為接種量4%、溫度30℃、初始pH自然（9.5），轉速設為0、30、60、90、120、150、180、210 r·min-1；初始pH試驗中培養條件為接種量4%、溫度30℃、轉速150 r·min-1，初始pH設為6、7、8、9、10。試驗所用菌液均為培養48 h時的新鮮菌液，對照組不添加菌液，每處理組3個重復。

1.2.3 菌株硫氧化Box-Behnken響應面優化

在4%接種量下，選取溫度、轉速、初始pH為考察因子，以2 h時S2-去除率作為響應值，根據Box-Behnken進行試驗設計，將所得試驗數據采用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合分析，變量的編碼和水平如表1所示。

表1 響應面試驗的編碼和水平設計Table 1 Encoding and horizontal design of response surface test

1.2.4 不同S2-負荷條件下的去除效果及動力學分析

將菌液按4%接種量接種至含不同濃度S2-（100、200、500、1 000 mg·L-1）的富集培養基中，并用經0.22 μm滅菌微孔濾膜過濾除菌后的HCl溶液調整培養基初始pH為8.2，在32.5℃、210 r·min-1條件下培養2 h測定反應液中S2-含量。采用One phase exponential decay（OPED、公式1）和Plateau followed by one phase decay（PFOPD、公式2）[15]兩種模型分析不同S2-負荷條件下的動力學特性。

式中：y為x時刻S2-濃度，mg·L-1；y0為x=0時的y值，mg·L-1；Plateau為最終時刻S2-濃度，mg·L-1；k為速率常數，h-1。

1.2.5 測定方法

S2-濃度采用流動注射-亞甲基藍分光光度法（北京吉天，FIA6000）測定，SO2-4濃度采用比濁法（美國哈希，DR 5000）測定，氨氣與硫化氫排放量分別用硼酸吸收凱氏定氮法和鋅銨絡鹽吸收比色法測定。

1.2.6 數據分析

試驗數據利用Microsoft Excel 2007處理，采用SPSS 26.0軟件進行方差分析（顯著性差異水平設置為0.05）。采用GraphPad Prism 8.0.2及Origin 2018軟件進行繪圖及動力學擬合。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的分離鑒定及S2-氧化能力測試

經過富集、分離、篩選得到一株高效異養硫氧化菌，菌株的16S rRNA基因測序鑒定（系統發育樹見圖2）表明該菌株屬于鹽單胞菌屬（Halomonas），命名為Halomonassp.AEB2。菌株AEB2對水中S2-的氧化效果及SO2-4的產量分析見圖3a和圖3b，從圖中可知菌株AEB2對S2-的氧化速率較快，在培養4 h后，S2-的濃度由100 mg·L-1下降至4 mg·L-1，較不接菌對照處理下降了92.7%（P＜0.05）。接菌處理組的硫酸鹽含量整個培養過程中趨向于零，且反應液顏色呈現出由無色至黃色并逐漸加深最終轉化為乳白色渾濁的現象，而對照組反應液始終保持清澈透明狀態，這與FAN等[27]報道的單質硫產生現象一致，由此推測菌株AEB2在對S2-的氧化過程中產生了單質硫。同時在反應過程中反應液pH由9.5升高至9.65，可判斷該菌屬于產堿型硫氧化菌。產堿型硫氧化菌主要通過S4I途徑產生連四硫酸鹽作為中間產物，使培養過程中反應液pH升高，該途徑多存在于鹽單胞菌屬及假單胞菌屬中[28]。高pH的反應體系在實際應用中更利于捕捉硫化氫氣體，而硫酸鹽的產生與積累常會導致生物反應器pH降低[29]，進而影響反應器運行的穩定性，因此菌株AEB2的這一特性有利于其在實際生產中的應用。目前對于鹽單胞菌屬細菌的研究主要有鹽堿環境的氮污染治理[30]、反硝化[31-32]、生物降解多環芳烴[33]等，而關于該屬細菌S2-氧化能力的研究較少[17，34-35]，WANG等[36]對該屬細菌反硝化及硫氧化基因進行系統整理，發現sqr、fccAB、pdo和tsdA等關鍵硫氧化基因在該屬細菌內廣泛存在，為菌株的應用提供了一定的理論支撐。

圖2 菌株AEB2與相關種的16S rRNA序列系統發育進化樹Figure 2 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of strain AEB2 and related species

菌株的生長曲線如圖3c所示，菌株AEB2在培養的前4 h生長緩慢，處于遲緩期階段，4 h之后菌株進入對數生長期，24 h左右進入穩定期，菌株生長速度放緩，約在48 h時達到頂峰，OD600值為2.6。總體來看，菌株AEB2生長較快且穩定期生物量大，利于在復雜環境中占據生態位。

2.1.2 菌株對奶牛場糞污硫化氫氣體的減排效果

能否在復雜環境中生長并發揮功能是檢驗優良菌株的重要因素，菌株AEB2對糞污中硫化氫及氨氣的減排效果見圖3d。結果表明，在1%的接種量下，接種3 d后接菌處理組的硫化氫排放量為32.94 μg，較不接菌處理組下降了47.1%，差異達到顯著水平（P＜0.05），表明菌株AEB2對于糞污中硫化氫氣體具有較好的減排效果。

圖3 菌株篩選試驗結果Figure 3 Strain screening test results

2.2 菌株的S2-氧化特性

2.2.1 接種量對S2-去除效果的影響

接種量試驗結果表明（圖4a），S2-的去除率隨接種量的增加呈逐步增長的趨勢。當接種量為1%～4%時，S2-去除率快速增長，為11.6%～98.2%；當接種量為4%～10%時，S2-去除率的增長趨勢減緩，為98.2%～99.9%。方差分析結果表明，4%～10%處理下S2-的去除率與1%、2%處理差異顯著（P＜0.05）。OD600的變化規律呈現出與S2-去除率相同的趨勢。由此可見，當接種量大于4%時即可快速啟動S2-的去除功能，縮短微生物生長的遲滯期。S2-對細菌具有一定的毒理性功能[37]，從而對細菌的生長產生一定的抑制作用。初始菌濃度增加后，S2-對細菌的抑制作用減弱，縮短了S2-去除的遲緩期；同時初始菌濃度不同會導致細菌生長速率差異，高接種量下細菌的生長速率較快，從細菌生長量的結果來看，接種量越高，OD600增量越大，S2-去除效果越強。

2.2.2 溫度對S2-去除效果的影響

溫度試驗結果表明（圖4b），當溫度從15℃上升至40℃時，S2-去除率與OD600均呈先升后降的趨勢。其中溫度為30℃時S2-的去除率最高，為98.5%。當培養溫度從15℃上升至30℃時，S2-去除率由54.8%逐步升高至98.5%，培養溫度由30℃升高至40℃時，S2-去除率穩定在92.0%～98.5%之間。方差分析結果表明，菌株AEB2在25～35℃時的生長狀況差異不顯著，同時在20～40℃區間內，S2-去除率均保持在80%以上，這說明菌株AEB2具有較廣的溫度適應性。

2.2.3 轉速對S2-去除效果的影響

搖床轉速影響溶液中溶解氧含量，進而影響微生物的生長及對S2-的氧化能力。轉速試驗結果表明（圖4c），菌株AEB2在不同搖床轉速下對S2-的去除效果不同。當搖床轉速為低速時（0～90 r·min-1），隨著搖床轉速的提高，S2-的去除率快速提高，為18%～70%；當轉速在90～210 r·min-1時，S2-去除率提升較小，為70.0%～78.0%。這說明轉速為90 r·min-1時已經基本滿足AEB2的硫氧化氧氣需求，搖床轉速為180 r·min-1時，菌株AEB2的OD600與S2-的去除率均最高，表明菌株AEB2在180 r·min-1時的生長狀況與S2-氧化能力最優。

2.2.4 初始pH對S2-去除效果的影響

pH是影響微生物生長的重要因素之一，初始pH試驗結果表明（圖4d），S2-去除率隨初始pH升高呈先升后降的趨勢。初始pH為6時S2-去除率僅為25.0%，當初始pH由6提高為7時，S2-去除率升高至81.3%，呈快速增長趨勢；當初始pH為8～10時，去除率緩慢下降，由98.7%下降至93.2%。初始pH為8時，S2-去除率及OD600均為最高，方差分析結果表明，初始pH在7～10區間內S2-的去除率差異不顯著，初始pH在8～9區間內菌株的生長狀況差異不顯著，說明菌株AEB2在中性偏堿的環境中S2-氧化能力較強。

圖4 不同條件對菌株AEB2硫化物氧化性能的影響Figure 4 Effects of different environmental conditions on sulfide oxidation performance of strain AEB2

2.3 菌株硫氧化Box-Behnken響應面優化

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及結果

為探究菌株最適的環境條件，以S2-去除率（Y）作為響應值，以溫度（A）、轉速（B）、pH（C）作為考察因素設計Box-Behnken試驗，利用Design-ExpertV8.061分析數據并進行多元回歸擬合。在試驗中控制接種量為4%，S2-濃度設置為100 mg·L-1，響應面結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experiment designs and results

2.3.2 回歸模型擬合及方差分析

利用Design-ExpertV8.061軟件進行回歸擬合后，得到回歸模型方程：Y=94.08+11.45A+4.14B+9.59C-0.33AB+3.98AC-4.1BC-11.54A2+1.53B2-15.77C2。

對回歸模型進行方差檢驗，結果見表3，其中F值為24.71，P=0.000 2，說明模型極顯著。模型失擬項用來表示所用模型與試驗結果的擬合程度，即二者差異程度，該模型P失擬=0.077 2（P失擬＞0.05），差異不顯著，無失擬因素存在；模型R2為0.97，RAdj為0.93，表明模型預測值與實際值擬合度較好，試驗誤差較小。綜上認為該模型可以用于預測S2-去除的最優環境參數。根據F值大小，得出3個因素對S2-去除率的影響大小為溫度＞pH＞轉速。

表3 響應面回歸模型方差分析表Table 3 Response surface regression model ANOVA table

2.3.3 響應面分析及最優條件確定

各因素交互作用對菌株S2-去除率的響應曲面圖和等高線圖如圖5所示，該圖可以直觀地解釋各變量對響應值的影響，其中響應面越陡峭證明該因素影響越大。從圖5可知，隨著溫度、pH、轉速的增加，菌株對S2-的去除效果逐漸增強，但溫度、pH增加到一定程度后，S2-去除率呈下降趨勢，而轉速則表現為小幅上升的趨勢。等高線圖的結果表明各因素間的交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

圖5 各因素交互作用對硫化物去除率影響的等高線圖和響應面圖Figure 5 Contour map and response surface diagram of the various factors on the sulfide removal efficiency

根據響應面模型的預測結果得出最優參數為32.5℃、210 r·min-1，pH 8.2，此參數下S2-去除效果最強，可達到100%。為驗證模型準確性，在溫度32.5℃、轉速210 r·min-1、初始pH 8.2條件下進行平行試驗，所得到的S2-去除率為99.9%，與模型預測結果相近，表明模型輸出可靠。

2.3.4 最優條件S2-去除效果研究

在最優條件下探究了菌株AEB2對S2-的去除效果，并與篩選試驗（30℃、150 r·min-1、初始pH 9.5）中S2-氧化能力測試時的效果進行比較，結果如圖6所示。結果表明，在相同時間下優化后S2-的去除率均高于優化前，其中優化后1.5 h時的去除率即可達到96.5%，較未優化前提升28.2個百分點，表明在32.5℃、210 r·min-1、初始pH 8.2的反應條件下，菌株AEB2的S2-氧化能力顯著增強。

圖6 優化前后硫化物的去除效果Figure 6 Comparison of sulfide removal effects after condition optimization

2.4 不同S2-負荷條件下的去除效果及動力學分析

菌株在不同S2-負荷條件下的去除效果如圖7所示。隨著初始S2-濃度增加，菌株AEB2氧化反應液中S2-所需的時間逐步增加，100、200、500、1 000 mg·L-1S2-濃度下達到完全去除的時間約為2、4、7、13 h。借助單相衰減模型[15]（OPED/公式1）對100、200、500 mg·L-1S2-濃度下的去除效果進行動力學擬合以及平穩期后單相衰減模型（PFOPD/公式2）對1 000 mg·L-1S2-濃度下的去除效果進行動力學擬合。OPED和PFOPD公式說明了不同濃度下的S2-去除效果隨時間變化的趨勢，模型擬合的k值代表不同濃度下的降解效率，分別為1.362 0、0.826 4、0.379 6、0.193 6 h-1，隨著S2-濃度增加降解效率逐步下降，這可能是高濃度S2-對菌株的生長抑制所導致，同時PFOPD模型的平穩期也進一步證實了該現象。

圖7 菌株AEB2在不同S2-負荷條件下的降解動力學Figure 7 Degradation kinetics of strain AEB2 under different S2-loading conditions

目前應用于生物除臭工程的硫氧化菌株多集中于硫桿菌屬、芽孢桿菌屬、硫葉菌屬、副球菌屬等[38-41]。與多數研究相比，菌株AEB2的S2-氧化性能較好，對S2-的可負荷濃度區間較廣，S2-氧化速率較快。如李敏等[42]所篩選出的糞產堿桿菌對500 mg·L-1的S2-在50 h時的去除率為84.89%，1 000 mg·L-1濃度下的去除率約為30%；CHEN等[43]篩選出的一株沙門氏芽孢桿菌對S2-的耐受濃度為400 mg·L-1，50 mg·L-1濃度下去除率最高為88%；MAHMOOD等[44]所篩選出的惡臭假單胞菌在缺氧條件下70 h可以去除200 mg·L-1的S2-；CHEN等[15]所篩選出的耐熱可赫氏菌可耐受400 mg·L-1的S2-，300 mg·L-1的S2-降解速率常數為0.053 7 h-1。菌株AEB2于1 000 mg·L-1的S2-的降解速率常數為0.193 6 h-1，13 h時即可達到99%以上的去除率，可見菌株AEB2對S2-的負荷較高，S2-氧化能力較強。

3 結論

（1）本研究從奶牛場污水池中篩選得到一株高效硫氧化細菌，經鑒定該菌株屬于鹽單胞菌屬（Halomonas），命名為Halomonassp.AEB2。菌株AEB2能快速有效地完成對水中S2-的氧化，在糞污中可起到使硫化氫顯著減排的效果。

（2）菌株AEB2具有較廣泛的溫度適應性，嗜中性及偏堿性，氧化S2-的最優參數為32.5℃、210 r·min-1、初始pH 8.2。

（3）菌株AEB2在100～1 000 mg·L-1的S2-負荷下的去除效果表明，該菌有較好的硫氧化性能，可作為硫化氫惡臭去除工程應用菌株。