A型肉毒毒素通過自噬途徑對大鼠皮瓣缺血再灌注的保護作用研究

崔 超，張 珊，林 煌

（1.北京懷柔醫院急診科 北京 100014；2.北京懷柔醫院腫瘤科 北京 100014；3.首都醫科大學附屬北京安貞醫院整形科 北京 100029）

游離皮瓣越來越多地用于修復嚴重外傷和腫瘤術后的皮膚和軟組織缺損。缺血再灌注損傷是不可避免的，會導致游離皮瓣顯著組織損傷[1]。盡管皮膚缺血再灌注損傷的病因尚不清楚，但越來越多的證據表明微血管塌陷和血流缺陷是皮瓣缺血再灌注損傷的主要環節[2]。內皮細胞凋亡可能導致血管通透性、微血栓形成和組織炎癥[3]。近年來，許多保護皮瓣的潛在方法和措施相繼被挖掘出來，如高壓氧、分子氫、缺血后處理等[4-5]，顯示出良好的發展前景。幾項研究表明，A型肉毒毒素（Botulinum toxin A，BTX-A）可以減輕動物模型上由缺血再灌注損傷引起的皮瓣壞死[6-7]。保護皮瓣的機制可能與增加血流量和血管舒張有關[8]。自噬是缺氧、低循環組織中細胞的一種保護作用，在維持細胞再灌注損傷等應激條件下的存活方面起著重要作用。研究證實，缺氧和復氧微環境導致血管內皮細胞損傷進而引起自噬基因表達增加[9]。本研究的主要目的是評估BTX-A對缺血再灌注損傷后大鼠皮瓣的保護作用是否與自噬有關。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：本研究經北京安貞醫院倫理委員會批準。均采用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自北京思貝福生物有限公司，體重300～350 g，在22℃～25℃標準條件下將大鼠圈養在12 h的明暗循環環境中。

1.2 實驗方法與分組：80只雄性SD大鼠隨機分為四組：I/R組（n=20）：缺血8 h后血流再灌注，I/R前7 d注射生理鹽水200 μl；BTX-A+I/R組（n=20）：缺血8 h后再灌注，I/R前7 d注射1 U BTX-A（Allergan，美國)，余操作同I/R組；BTX-A+I/R+3-MA（3-甲基腺嘌呤，自噬拮抗劑，Sigma，美國）組（n=20）：再灌注前20 min注射3-MA（30 mg/kg），其他處理同BTX-A組；假手術組（n=20）：無缺血/再灌注，前7 d注射生理鹽水200 μl。見圖1。

圖1 實驗方案示意圖

1.3 操作方法：大鼠用1%戊巴比妥鈉（5 ml/kg）麻醉。整個腹部區域備皮，并在大鼠身上設計了一個3 cm×6 cm的左側腹股溝皮瓣（見圖2）。結扎左股血管的其他分支，皮瓣保留淺表腹壁血管作為血管蒂。用微血管鉗夾住左股血管8 h，夾緊位置靠近左股血管的胯部（見圖3～4）。1 U BTX-A或生理鹽水注射到蒂附近的皮下層。3-MA（30 mg/kg）通過腹腔注射給藥。在缺血期結束時，移除夾子（見圖5）。使用5-0尼龍線（Ethilon，Johnson，美國）進行連續縫合。

圖2 皮瓣缺血再灌注設計面積

圖3 左腹部股動脈和股靜脈的解剖位置

圖4 腹壁淺血管帶血管蒂皮瓣解剖圖

圖5 5-0尼龍線連續縫合

1.4 HE染色：從皮瓣存活區域取出皮瓣組織片（每個約1 cm2大小）。將樣品切片并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的4%多聚甲醛固定。然后包埋在石蠟中，固定在載玻片上，進行HE染色。檢測皮瓣組織和微血管的病理情況。同時，計算血管密度。

1.5 免疫組化（CD34&LC3）染色：切片通過抗體孵育、蘇木精染色、封固，用于觀察血管生成和LC3的表達。

1.6 Tunel染色：將50 μl POD加入到暗濕箱中帶有蓋玻片或密封膜的標本中；進行DAB染色、自來水沖洗、蘇木精復合染料和1%鹽酸分化。安裝后進行顯微鏡觀察。凋亡細胞核呈棕色和黃色。通過選擇含有微血管的切片，計算在高倍視野（400次）下沿血管分布的凋亡細胞數。

1.7 皮瓣壞死區的評估：術后第7天使用數碼相機評估皮瓣存活率。使用Image J軟件（1.51版，美國國立衛生研究院）確定皮瓣的存活面積和壞死面積。正常皮膚是柔軟、溫暖和粉紅色的。壞死的皮膚為腫脹、變黑、變硬和變冷。然后計算壞死面積的百分比。

2 結果

2.1 BTX-A可防止缺血再灌注引起的皮瓣壞死：本次所有大鼠均存活。圖6顯示了術后第1天、第3天、第5天和第7天各組皮瓣的存活和壞死狀態。與假手術組相比，缺血再灌注處理增加了皮瓣的壞死面積；BTX-A+I/R組的壞死百分比低于I/R組，BTX-A+I/R+3-MA組的壞死百分比高于BTX-A+I/R組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖7。

圖6 各組術區情況

圖7 各組皮瓣壞死率

2.2 HE染色結果：假手術組皮瓣組織結構正常，可見大量血管，組內未見炎性浸潤。I/R組皮瓣組織結構疏松，血管數量明顯減少，分布著大量的炎性細胞。與I/R組相比，BTX-A+I/R組皮瓣組織正常，血管數量增多，炎癥浸潤不明顯。與BTX-A+I/R組相比，BTX-A+I/R+3-MA組血管分布減少并顯示出炎癥浸潤。見圖8～9。

圖8 各組皮瓣組織HE染色結果（100×）

圖9 各組皮瓣組織微血管計數

2.3 免疫組化（CD34&LC3）結果：圖10可知，假手術組皮瓣組織血管內皮細胞CD34陽性，細胞質是棕色的，排列成一個圓圈。與假手術組相比，I/R組皮瓣組織結構松散，血管明顯縮小。與I/R組相比，BTX-A+I/R組CD34陽性細胞數增加。BTX-A+I/R+3-MA組血管組織數量少于BTX-A+I/R組。圖11可知，LC3陽性表達為棕黃色。BTX-A+I/R組皮瓣組織中LC3的表達水平高于I/R組。BTX-A+I/R+3-MA組LC3的表達水平降低。

圖10 各組CD34免疫組化染色結果（400×）

圖11 各組LC3 IHC染色結果（400×）

2.4 Tunel染色結果：假手術組凋亡細胞較少（見圖12），但I/R組凋亡細胞比例明顯增加。BTX-A+I/R組皮瓣組織凋亡細胞百分比明顯低于I/R組。BTX-A+I/R組抗凋亡作用被3-MA減弱。見圖13。

圖12 各組TUNEL染色結果（400×）

圖13 各組TUNEL陽性細胞比例

3 討論

盡管保護游離皮瓣的綜合治療措施不斷完善，游離皮瓣的成活率仍為90%～95%[10]。分析抗再灌注損傷的分子機制，確立皮瓣的靶點，具有現實的緊迫性。早在1986年，Murry在心肌缺血研究中就提出了預處理的概念[11]。研究表明，藥物預處理可以通過增強缺血再灌注中的自噬作用來減弱內皮細胞凋亡[12]。

肉毒毒素是肉毒桿菌在生殖過程中分泌的一種有毒蛋白質。肉毒毒素存在多種亞型（A、B、C、D、E、F、G），其中A型研究得最為清楚。目前已經揭示了BTX-A對皮瓣缺血再灌注損傷的保護作用[13-14]，這與本次結果一致。在本研究中，BTX-A+I/R組的壞死百分比低于I/R組。與I/R組相比，該組血管存活數增加，細胞凋亡數減少。然而，其機制尚不清楚。缺血再灌注損傷誘導炎癥，包括白細胞和巨噬細胞的浸潤和促炎細胞因子的產生，并導致血管內皮、毛細血管功能障礙，狹窄、血管梗塞和血管痙攣。這些血管損傷導致組織缺氧和氧化應激，導致這些組織的凋亡和壞死[15]。本研究中進行HE染色和CD34（一種新血管生成相關細胞表面蛋白，作為組織對缺血再灌注損傷的保護程度的標志），以上兩個結果表明，I/R組的血管數少于假手術組。Tunel染色顯示I/R組細胞凋亡數高于假手術組。

研究表明，自噬與大鼠皮瓣的存活有關[16]。然而，目前尚沒有證據表明自噬參與了BTX-A的保護機制。足夠的證據表明，自噬在缺血再灌注過程中在人體重要臟器中起著重要作用[17]。然而，自噬在皮瓣缺血再灌注中的作用尚未得到充分報道。這些器官的自噬機制可能與細胞凋亡的調節有關。本研究中，由于自噬阻滯劑的應用，皮瓣成活面積百分比、皮瓣血管分布均較BTX-A組降低，皮瓣炎癥浸潤和細胞凋亡增多。同時，3-MA注射后LC3的表達水平低于BTX-A+I/R組。說明BTX-A通過增強自噬保護皮瓣缺血再灌注損傷。本研究為提高皮瓣移植成功率提供了一種新的理論方法。

雖然本次證明BTX-A可以防止缺血再灌注損傷，但該研究有局限性。首先，皮瓣的血管損傷量測量不充分，在未來的研究中，可以通過蛋白質印跡或逆轉錄酶聚合酶鏈反應確定VEGF（血管內皮生長因子）、iNOS（誘導型一氧化氮合酶）和CD34。此外，可以利用這些方法進一步評估相關的凋亡蛋白（如Caspase-3、Bcl-2）及自噬相關蛋白。總之，本次研究結果可能有助于制定相關的轉化方案，以提高顯微游離皮瓣術后組織的存活率，未來需要進一步的研究來闡明BTX-A在皮瓣上的確切機制。