MPN法在注射用利福平中間體需氧菌總數檢測中的研究

王連國 易大為 周少彤 馬輝

【關鍵詞】利福平；中間體；需氧菌總數；MPN

利福平（Rifampicin）是利福霉素B的一種衍生物，具有抗菌力強，抗菌譜廣的特性。其低濃度抑菌，高濃度殺菌，對結核桿菌、多數革蘭氏陽性菌有強大快速的抗菌作用，同時對麻風桿菌、某些革蘭氏陰性菌有抑制作用[1]。通常利福平被制成膠囊或片劑等口服劑型，與其他抗結核藥合用協同殺菌，而注射用利福平作為利福平口服制劑的替代劑型，在病人不耐受口服治療時使用[2]。

目前國內尚無用于利福平無菌制劑直接分裝的原料藥。注射用利福平的一般工藝是在利福平非無菌原料藥中加入適當助溶劑，經濃配、稀釋、除菌過濾、冷凍干燥而成。有文獻指出，非無菌物料除菌過濾前的生物負載應盡量最小化，以防止對過濾介質的挑戰，降低最終產品的品質，有必要設定預過濾中間體的微生物限度[3]。通常建議最終過濾除菌前，料液的微生物負荷不超過10 cfu/100 mL[4]。可見，未經過濾除菌的料液的生物負載，即注射用利福平中間體的微生物污染水平是注射用利福平無菌工藝過程的關鍵指標，關乎注射劑成品的無菌水平。因此，建立注射用利福平中間體微生物限度的檢查方法具有一定的現實意義，具體研究如下。

1 試驗材料

1.1 供試樣品

注射用利福平中間體，批號：20201204、20201210，沈陽某藥廠生產。

1.2 儀器

HFSAFE-1500 生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；KB240 培養箱（Binder corporation Germany）；SX-700 高壓滅菌器（TOMY. KOGYO. Japan）；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；GN-6 Metricel Grid 濾膜及濾器（Pall corporation USA）；MaxQ 4000 恒溫搖床（賽默飛世爾科技有限公司）；HTY-2000A集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；EVS3 全封閉式濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司）。

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供。上述試驗菌經復蘇、傳代，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數約為10～102 cfu/ml的溶液，臨用新制。

1.4 試劑

丙三醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160203）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號2019318）。

1.5 培養基

胰酪大豆胨液體培養基（TSB，北京三藥科技開發公司，批號20200918）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，北京三藥科技開發公司，批號20201015）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，北京三藥科技開發公司，批號20201015）；SCDLP 液體培養基（北京三藥科技開發公司，批號20200921）。上述培養基均為即用型成品培養基，使用前進行培養基適用性檢查，均符合規定。

2 試驗方法

2.1 薄膜過濾法測定需氧菌總數的驗證試驗

由于利福平抗細菌力很強，驗證試驗中每張濾膜的載藥量均設置為10 mL的注射用利福平中間體，污染微生物的限度擬設定≤1 cfu/10mL。取10 mL的注射用利福平中間體，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至200 mL，作為供試品溶液，臨用新制。

取供試品溶液200 mL 經薄膜過濾，用保溫至44 ℃的含5%丙三醇的SCDLP液體培養基1000 mL沖洗濾膜濾器，每次沖洗量為100 mL，在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu 金黃色葡萄球菌，過濾，轉移濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上。

按上述處理方法，分別在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu 的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，過濾，轉移濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數、陰性對照。上述平板于30～35 ℃倒置培養3～5 天，觀察，計數。

2.2 MPN法結合薄膜過濾法測定需氧菌總數的驗證試驗

本試驗主要考察擬定方法去除抗菌活性成分的效果。取注射用利福平中間體30 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至400 mL，作為供試品溶液①；取中間體3 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至40 mL，作為供試品溶液②；取中間體0.3 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10 mL，作為供試品溶液③，備用。

取三聯集菌器，用0.9%無菌氯化鈉溶液潤濕濾器及濾膜。取供試品溶液①400 mL，全部通過三聯集菌器過濾。用2700 mL的含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基沖洗濾器，每次每膜沖洗100 mL，在最后一次沖洗液中分別于每個濾筒中加入小于100 cfu 的金黃色葡萄球菌，過濾，每個濾筒中各加入100 mL 的胰酪大豆胨液體培養基。在30～35 ℃培養3天，觀察結果。

又取MPN法供試品溶液①，按上述方法操作，分別于每個濾筒中加入小于100 cfu 的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，過濾，每個濾筒中各加入100 mL的胰酪大豆胨液體培養基。在30～35 ℃培養3 天，觀察結果。

2.3 MPN法結合薄膜過濾法測定需氧菌總數的適用性試驗

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌菌液（10～102 cfu/mL）作為第一稀釋級的試驗菌液；繼續10 倍稀釋和100 倍稀釋，作為第二稀釋級和第三稀釋級的試驗菌液。

取MPN法供試品溶液①400 mL全部通過三聯集菌器過濾，用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養基沖洗濾器，每次每膜沖洗100 mL，各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養基，各管中接種第一稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液；取MPN法供試品溶液②40 mL全部通過三聯集菌器過濾，用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養基沖洗濾器，每次每膜沖洗100 mL，各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養基，各管中接種第二稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液；取MPN法供試品溶液③10 mL全部通過三聯集菌器過濾，用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養基沖洗濾器，每次每膜沖洗100 mL，各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養基，各管中接種第三稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液。

上述9 管于30～35 ℃培養3 天，觀察，計數。根據微生物生長的管數，從《中國藥典》2020 版“1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”表3 試驗組中查金黃色葡萄球菌的最可能數[5]。另取三套三聯集菌器，各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養基，每一稀釋級金黃色葡萄球菌菌液取3 份1 mL分別接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，于30～35 ℃培養3 天，觀察，計數。根據微生物生長的管數從表3 中查菌液對照組中金黃色葡萄球菌的最可能數及對照組菌數的95%置信限。其他試驗菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌）的計數方法同金黃色葡萄球菌。

2.4 含中和劑沖洗液無毒性的證實試驗

取三聯集菌器，用1000 mL的含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基沖洗濾器，每次每膜沖洗100 mL，在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu 的試驗菌，各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養基，在30～35 ℃培養3天，觀察結果。

3 結果

3.1 薄膜過濾法的驗證試驗結果

試驗結果見表1。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌試驗組菌回收率均低于0.5，銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗組菌回收率在0.5～2 范圍內，按照《中國藥典》2020 版“1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”供試品中微生物回收的判定原則，上述方法不適于需氧菌總數測定。

3.2 MPN法結合薄膜過濾法的驗證試驗結果

試驗結果見表2。用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基沖洗濾器9 次，各試驗菌在72 h 內生長良好，可以按此方法去除抗菌活性。

3.3 MPN法結合薄膜過濾法計數方法適用性試驗結果

試驗結果見表3。采用MPN法結合薄膜過濾法，各試驗菌的菌數均在各菌液對照組菌數的95%置信限內，可作為此品種的需氧菌總數的計數方法。

3.4 含中和劑沖洗液無毒性證實試驗結果

試驗結果見表4，各試驗菌在規定時間內均生長良好，含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基對各試驗菌無毒性。

4 結果

4.1 經驗證，注射用利福平中間體需氧菌總數可采用MPN法結合薄膜過濾法測定

在規定培養條件下，若供試品各濃度的試驗管均無菌生長，即生長管數為0、0、0，則每100 mL中間體中污染的需氧菌總數報告值<3 cfu，該計數方法的檢出限低于本品預設微生物污染最大允許值10 cfu/100 mL，可用于本品需氧菌總數測定。

4.2 注射用利福平（中間體）-微生物限度檢查法正文表述

分別取本品30 mL（相當于3 份10 mL）、3 mL（相當于3 份1 mL）和0.3 mL（相當于3 份0.1 mL），分別溶于0.9%無菌氯化鈉溶液400 mL、40 mL 和10 mL 中，作為供試品溶液①、②和③。

取全封閉濾器3 組，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液潤濕濾器及濾膜。取供試品溶液①，經薄膜過濾法處理，用44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基2700 mL分次沖洗，每次每膜沖洗100 mL，沖洗9 次，各管中加胰酪大豆胨液體培養基100 mL；同法處理供試品溶液②和③。按《中國藥典》2020 版中規定的MPN法進行培養，記錄每一稀釋級微生物生長的管數，從表3 中查每100 mL 供試品中需氧菌總數的最可能數。每100 mL供試品中需氧菌總數不得過10 cfu。

5 討論

雖然MPN 法（Most-Probable-Number Method）用于微生物計數時精確度較差，但對微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是最適合的方法[6]，比較適合本品種的限度要求。利福平對多種病原微生物均有較強抗菌活性，本品設定的微生物污染允許限又相對苛刻，這種情況下MPN法更適宜注射用利福平中間體需氧菌總數測定。

SCDLP 液體培養基中含有一定量的中和劑和表面活性劑，每1000 mL培養基中含蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g，卵磷脂1 g，吐溫-80 7 g。沖洗液使用44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養基，丙三醇有一定的助溶作用，溫熱的沖洗液可提高沖洗效果。

《中國藥典》指出MPN法不適于霉菌計數，考慮利福平的抗菌譜中不包括霉菌，故本品仍存在霉菌污染的風險，宜參考有關研究[7]，增加霉菌數檢測。