基于近、中紅外光譜的熱毒寧注射液制劑過程投料和二次熱處理工序快速檢測方法研究

童 楓，徐芳芳，張 欣，李執(zhí)棟，吳 云，章晨峰，王振中

基于近、中紅外光譜的熱毒寧注射液制劑過程投料和二次熱處理工序快速檢測方法研究

童 楓1，徐芳芳2, 3*，張 欣2, 3，李執(zhí)棟2, 3，吳 云2, 3，章晨峰2, 3，王振中2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

應用近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）與中紅外光譜（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技術，對熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）制劑過程的投料和二次熱處理工序中6種質控指標進行快速檢測，提高制劑過程的質量控制水平。利用NIRS透射技術與MIRS衰減全反射技術，結合偏最小二乘法（partial least squares，PLS），經過光譜預處理方法的優(yōu)選以及波段篩選，分別建立綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的快速預測模型，以校正集相關系數(shù)（cal）、驗證集相關系數(shù)（pre）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）、預測相對誤差（relative standard error of prediction，RSEP）為評價指標，評價模型性能。NIRS預測模型的6個質控指標的RMSEC和RMSECV均小于0.3，RSEP小于4.0%；MIRS預測模型的6個質控指標的RMSEC和RMSECV均小于0.4，RSEP均小于5.0%，建立的PLS模型具有模型性能好、預測精度高的優(yōu)點。NIRS及MIRS分析技術，均可用于RI投料和二次熱處理工序中6種質控指標的快速檢測，模型RSEP在5%以內，方法操作簡單，結果可靠。

近紅外光譜；中紅外光譜；熱毒寧注射液；制劑過程；光譜預處理；波段篩選；偏最小二乘法；綠原酸；新綠原酸；隱綠原酸；梔子苷；斷氧化馬錢子苷；固含量

熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）是江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司的獨家品種，由青蒿、金銀花、梔子3味藥材制得，具有清熱、疏風、解毒的功效，常用于上呼吸道感染所致的高熱、微惡風寒、頭身痛、咳嗽、痰黃等癥狀及抑制流感病毒[1-2]。在中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第九版）》中，針對重型、危重型新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者推薦的中成藥中，RI也名列其中[3]。

RI的生產過程可以分為提取、精制和制劑過程，目前，利用近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）或中紅外光譜（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技術結合化學計量學，針對RI提取、精制過程的快速檢測已較為成熟，并取得一定的應用效果[4-8]。但是，基于NIRS和MIRS的RI制劑過程的快速檢測研究尚未見報道。因此，基于RI的制劑過程，研究合適的快速檢測方法，可為RI制劑過程的質量控制水平的提升提供技術支撐。NIRS以及MIRS作為過程分析技術的典型代表，近年來發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的化學分析方法相比，這2種光譜分析方法具有以下優(yōu)點：（1）可同時用于定性和定量分析；（2）分析速度快，只需掃描得出光譜即可測定樣品中的各種成分；（3）不使用化學試劑，不損害樣品，對環(huán)境友好；（4）分析成本低，操作簡單[9-11]。

投料和二次熱處理工序指的是投料和二次熱處理2個連續(xù)工序，即在一定的溫濕度以及壓力下，依次將梔子提取物以及青金提取物投入到合并一定比例的注射用水和鹽酸的配液罐中，待冷卻后轉移至冷藏罐；冷藏罐內藥液通過板框過濾器濾過至熱配間熱配罐中，調節(jié)蒸氣壓力以及藥液溫度，一段時間后對藥液進行冷卻。

投料和二次熱處理工序作為RI制劑過程的初始工序，在實際生產中，會出現(xiàn)提取物溶解不充分等情況，導致有效成分的損失，直接影響最后的成品質量，因此，亟需引入1種快速檢測方法，降低生產過程控制風險。本實驗將NIRS和MIRS技術與化學計量學結合，首次應用于RI制劑過程，建立投料和二次熱處理工序6種關鍵質控指標的偏最小二乘（partial least squares，PLS）定量校正模型，實現(xiàn)對綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量的快速測定。

1 材料與儀器

1.1 材料

59批次的投料工序樣本（批號Z220123～Z2201240、Z220201～Z220232、Z220301～Z220309）及對應批次的59批次的二次熱處理工序樣本，共118批次樣品，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司水針車間提供。對照品綠原酸（批號110753-202018，質量分數(shù)96.1%）、梔子苷（批號110749-201919，質量分數(shù)97.1%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新綠原酸（批號DSTDX001503，質量分數(shù)99.58%）、斷氧化馬錢子苷（批號DST211224-111，質量分數(shù)98.87%）購自成都樂美天醫(yī)藥-德思特生物技術有限公司；隱綠原酸對照品（批號ST07850120，質量分數(shù)98.04%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。

1.2 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀、Antaris II型傅立葉變換NIRS儀，配有透射檢測器、采樣軟件以及Result、CAMO等數(shù)據(jù)處理軟件，（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；React IR 702L型MIRS儀、XP6型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BSA 224S-CW型萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Academic型純水機，美國Millipore公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

采用Unscramble X 10.4（挪威Camo Analytics公司）軟件進行光譜預處理；采用GraphPad Prism 8.0（美國GraphPad Software）繪圖；采用Matlab R2018a（美國MathWorks公司）軟件進行樣本劃分、波段篩選及模型構建。

2 方法與結果

2.1 NIRS的采集

以空氣為掃描背景，采用NIRS技術于室溫下采集光譜，選擇1 mm比色皿，光譜掃描范圍4000～10 000 cm?1，掃描次數(shù)為64次，分辨率4 cm?1，衰減器選擇B模塊，1倍增益，每個樣品采集3次，取平均光譜，得到59批投料工序樣本及59批二次熱處理工序樣本，共計118個樣本。NIRS結果見圖1。

2.2 MIRS的采集

在室溫條件下，使用光纖探頭掃描樣品，以空氣為掃描背景；光譜掃描范圍3000～650 cm?1；掃描次數(shù)32次；分辨率8 cm?1；增益選擇“l(fā)ow”，每個樣品掃描2次，取其一作為樣本光譜，得到59批投料工序樣本及59批二次熱處理工序樣本，共計118個樣本。MIRS結果見圖2。

圖1 118批樣本的NIRS平均光譜圖

圖2 118批樣本的MIRS圖

2.3 5種質控指標含量的測定

2.3.1 HPLC分析色譜條件 參照崔小弟等[12]的實驗結果，色譜條件設為Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，6 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；體積流量0.7 mL/min；進樣量10 μL；柱溫20 ℃；檢測波長238、327 nm。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 mL樣品置于20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 樣品測定 取118批次樣品，按照“2.3.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項色譜條件進樣測定，每份樣品平行2次測定，取平均值，作為建模的質控指標含量實測值。6種質控指標的含量測定結果見表1。

2.4 固含量的測定

參照文獻方法[13-14]，稱取約5 g樣品至已烘干至恒定質量的稱量瓶（0）中，稱定質量（1），置烘箱105 ℃條件下烘干5 h至恒定質量，計為2。

表1 樣本中6種質控指標統(tǒng)計值(n = 2)

Table 1 Statistical values of six quality control indicators in samples (n = 2)

質控指標質量濃度/(mg·mL?1)固含量/% 綠原酸新綠原酸隱綠原酸梔子苷斷氧化馬錢子苷 最小值8.768 82.066 82.304 312.285 41.116 27.295 3 下四分位數(shù)9.405 62.349 42.601 212.791 31.178 77.765 5 上四分位數(shù)10.279 12.619 42.898 014.254 11.432 78.221 8 最大值10.606 12.809 43.052 015.311 11.506 98.725 7 均值9.851 82.478 32.740 813.633 51.302 37.995 1

固含量＝(2－0)/(1－0)

2.5 校正集與驗證集的劃分

采用Kennard-Stone（K-S）劃分法[15]，將收集的59批投料工序樣品以及對應批次的59批二次熱處理工序樣品，共計118批樣品，以4∶1的比例劃分為校正集和驗證集，最終得到校正集樣本94個，驗證集樣本24個。

2.6 光譜預處理

采集光譜時，由于受到環(huán)境溫度、濕度、儀器狀態(tài)、雜散光和隨機噪聲等因素的影響，紅外光譜會出現(xiàn)基線漂移和噪聲干擾等問題，因此，在建模前對光譜進行適當?shù)念A處理是有必要的，可以有效地減少噪聲，凈化無用信息，提高模型的精度和預測效果。常見的預處理方式有：移動平均法（moving average，MA）、Savitzky-Golay（S-G）平滑法、導數(shù)法（一階導數(shù)、二階導數(shù)）、矢量歸一化法、基線校正、標準正態(tài)變換（standard normal transformation，SNV）、多元散射校正（multivariate scattering correction，MSC）以及上述方法的結合。MA和S-G平滑法可以消除光譜信息中的隨機噪聲，提高信噪比；一階導數(shù)可以消除背景的常數(shù)平移，二階導數(shù)可以消除背景的線性平移，消除背景漂移造成的影響；矢量歸一化法通過增強光譜數(shù)據(jù)間的差異，校正由光程變化或者樣品濃度改變引起的光譜變化；基線校正可以消除儀器背景漂移對信號的影響；SNV和MSC可以消除由于樣品分布不均勻對光譜造成的影響[16]。

本研究采用MA、S-G平滑、S-G 1st、基線校正、歸一化法以及SNV分別對NIRS和MIRS進行預處理，并分別建立投料和二次熱處理工序的6種質控指標的PLS定量校正模型。根據(jù)模型評價指標篩選出最佳的光譜預處理方法，使用留一交叉驗證法確定校正模型中的最佳的潛變量數(shù)（latent variables，LVs），以預測相對誤差（relative standard error of prediction，RSEP）為主要評價指標，RSEP值越小越好。一般而言，性能優(yōu)異的預測模型應具有較高的校正集相關系數(shù)（cal）及驗證集相關系數(shù)（pre）、較小且接近的校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及較低的RSEP[17]。上述評價指標的相關公式為式（1）～（4）。

cal＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（1）

pre＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（2）

RMSEC＝[∑(－y)2/]1/2（3）

RSEP＝[∑(－y)2/∑2]1/2（4）

、為校正集、驗證集樣本數(shù)，為實測值，y為預測值，y、y分別為校正集和驗證集實測值的平均值

NIRS和MIRS預處理結果見表2、3，可以發(fā)現(xiàn)：基于NIRS，當綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量分別以SNV、MA、MA、無預處理、SNV和歸一化法為預處理方法時，RSEP最小，且都在4.0%以下，此時，cal與pre值較大，RMSEC與RMSECV值較小且接近；基于MIRS，當綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量的預處理方法分別為無預處理、MA、MA、MA、SNV和無預處理時，模型具有較低的RSEP，均小于5%，較大的cal與pre值以及較小且接近的RMSEC與RMSECV值，從預處理方法的比較中可以猜測，在MIRS中，MA適合多數(shù)質控指標，可能是由于其減輕了光譜信息自身攜帶的隨機誤差，提高信噪比。

2.7 光譜波段的篩選

全光譜模型的準確性和穩(wěn)健性可能會因為一些無關信息的存在而減弱，篩選光譜波段可以剔除無用信息，提高模型的預測精度和穩(wěn)定性。本研究在上述篩選出的最佳預處理方法的基礎上，對比全光譜、間隔PLS（interval PLS，iPLS）、組合間隔PLS（synergy interval PLS，siPLS）及移動窗口PLS（moving windows PLS，mwPLS）建模的效果。

2.7.1 iPLS篩選最優(yōu)波段 iPLS是由N?rgaard等[18]提出的一種光譜區(qū)間篩選方法，通過將全光譜平均分為若干子區(qū)間，在各子區(qū)間內以不同的潛變量數(shù)建立獨立的PLS回歸模型[19]。本研究將光譜區(qū)間均分為20個子區(qū)間，并以RMSECV作為評價指標，篩選出最優(yōu)建模波段。

2.7.2 siPLS篩選最優(yōu)波段 siPLS是在iPLS的基礎上，對不同子區(qū)間進行任意組合，建立所有可能的2、3或4個區(qū)間的PLS回歸模型[20]。本研究將光譜區(qū)間均分為20個子區(qū)間，以子區(qū)間組合數(shù)為3建立模型，以RMSECV作為評價指標，篩選出最優(yōu)建模波段。

2.7.3 mwPLS篩選最優(yōu)波段 mwPLS的基本思想是將1個窗口沿著光譜軸連續(xù)移動，每移動1個波長點，采用交叉驗證法確定最佳潛變量數(shù)并建立相應的PLS最優(yōu)模型[21]。本研究以全光譜波數(shù)的10%作為窗口寬度，以RMSECV作為評價指標，篩選出最優(yōu)建模波段。

表2 NIRS不同預處理方法建模結果分析

Table 2 Analysis of modeling results of different NIRS pretreatment methods

質控指標預處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs質控指標預處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸無預處理0.979 80.088 10.158 50.933 31.717 515梔子苷無預處理0.975 40.187 40.257 10.974 61.100 912 MA0.976 00.096 00.164 50.924 01.828 116 MA0.979 00.203 50.276 30.972 81.168 512 S-G平滑0.975 70.096 60.159 70.926 41.788 715 S-G平滑0.972 50.197 90.269 60.974 41.120 012 S-G 1st0.982 50.082 20.186 00.922 21.818 210 S-G 1st0.998 80.041 40.290 10.948 21.551 116 基線校正0.980 00.087 80.176 40.932 01.709 315 基線校正0.974 70.189 90.274 40.975 01.132 612 歸一化法0.971 30.104 70.153 80.945 51.544 112 歸一化法0.998 90.039 80.177 00.975 51.077 620 SNV0.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 SNV0.999 00.038 70.175 40.974 71.086 620 新綠原酸無預處理0.834 30.096 80.127 00.829 93.934 610斷氧化馬無預處理0.973 00.030 2 0.049 1 0.960 22.573 814 MA0.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010錢子苷MA0.984 70.023 0 0.048 7 0.947 52.860 518 S-G平滑0.818 50.099 60.128 80.843 13.820 910 S-G平滑0.984 80.023 0 0.050 2 0.956 52.708 017 S-G 1st0.957 10.050 20.118 10.686 45.084 410 S-G 1st0.993 80.014 7 0.046 8 0.965 92.546 312 基線校正0.799 00.104 30.134 50.846 93.807 19 基線校正0.993 70.014 8 0.045 5 0.963 12.556 418 歸一化法0.849 10.094 30.123 90.837 43.847 010 歸一化法0.974 40.029 7 0.047 3 0.963 82.533 114 SNV0.838 30.103 10.130 80.840 13.850 69 SNV0.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 614 隱綠原酸無預處理0.872 40.085 10.111 60.942 42.591 110固含量無預處理0.973 40.077 70.131 60.941 21.378 415 MA0.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 MA0.970 50.081 80.133 20.936 11.423 917 S-G平滑0.868 00.086 50.111 60.950 22.527 310 S-G平滑0.967 70.085 50.128 80.943 91.388 215 S-G 1st0.978 00.036 30.098 50.922 23.170 511 S-G 1st0.995 50.031 90.151 70.906 21.704 714 基線校正0.882 10.082 10.110 80.941 22.725 010 基線校正0.975 10.075 30.138 60.927 71.488 515 歸一化法0.881 60.082 10.108 10.949 82.548 210 歸一化法0.978 20.070 40.120 60.952 91.259 115 SNV0.885 40.080 80.106 40.945 32.551 610 SNV0.978 50.069 90.119 90.948 61.309 915

除固含量的RMSEC與RMSECV的單位為“%”外，其余5種指標的RMSEC與RMSECV的單位均為“mg?mL?1”，下表同

except the unit of RMSEC and RMSECV of solid content is “%”, the units of RMSEC and RMSECV of the other five indicators are all “mg?mL?1”, same as the following table

表3 MIRS不同預處理方法建模結果分析

Table 3 Analysis of modeling results of different MIRS pretreatment methods

質控指標預處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs質控指標預處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸無預處理0.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46梔子苷無預處理0.911 40.350 00.594 30.723 13.883 16 MA0.916 40.176 60.268 20.870 02.374 89 MA0.968 10.212 90.577 80.822 93.093 019 S-G平滑0.938 20.152 60.280 30.866 62.352 69 S-G平滑0.908 10.356 20.602 90.704 34.062 38 S-G 1st0.929 20.163 10.313 20.849 62.529 38 S-G 1st0.963 30.228 10.667 60.745 64.248 716 基線校正0.925 90.166 40.293 30.861 02.390 27 基線校正0.912 70.347 40.608 10.720 03.761 06 歸一化法0.900 10.191 90.308 80.841 82.623 86 歸一化法0.922 00.329 10.657 60.696 94.207 28 SNV0.909 90.182 70.312 60.836 82.639 76 SNV0.897 60.374 70.655 20.652 64.355 56 新綠原酸無預處理0.802 10.103 50.150 10.738 54.691 85斷氧化馬無預處理0.870 70.0650 0.1133 0.780 15.630 66 MA0.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58錢子苷MA0.836 70.0724 0.0972 0.736 46.110 47 S-G平滑0.744 80.115 70.156 40.701 74.935 95 S-G平滑0.869 90.0652 0.1112 0.739 86.084 88 S-G 1st0.798 30.104 40.163 10.774 14.728 16 S-G 1st0.967 30.0335 0.0977 0.727 37.128 516 基線校正0.815 60.100 40.154 90.721 84.877 85 基線校正0.900 60.0576 0.1121 0.802 85.308 27 歸一化法0.812 90.100 90.144 10.750 74.566 55 歸一化法0.883 00.0620 0.1080 0.787 85.455 56 SNV0.808 90.101 90.146 20.743 34.634 85 SNV0.897 00.0584 0.1085 0.806 85.247 96 隱綠原酸無預處理0.893 60.087 80.134 20.799 64.848 55固含量無預處理0.914 60.138 50.230 20.784 22.547 06 MA0.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 MA0.959 30.095 70.221 90.796 62.822 916 S-G平滑0.863 50.087 70.148 10.802 04.798 07 S-G平滑0.882 00.159 90.239 10.718 92.882 66 S-G 1st0.821 60.099 10.151 40.831 94.441 3 5 S-G 1st0.922 70.121 30.265 90.775 12.748 010 基線校正0.842 70.093 70.145 10.801 74.770 05 基線校正0.901 30.147 00.241 60.765 82.596 66 歸一化法0.852 30.091 00.134 10.813 24.855 35 歸一化法0.908 80.141 40.256 20.725 12.931 17 SNV0.847 00.092 40.137 80.822 94.587 05 SNV0.910 80.139 90.253 80.707 83.010 77

2.7.4 最優(yōu)波段篩選結果 由3種波段篩選方法建立的模型與全光譜模型的性能參數(shù)對比結果見表4，以RMSEC、RMSECV和RSEP作為評價指標，綜合評價，篩選出最優(yōu)建模波段。結果表明，基于NIRS，綠原酸和斷氧化馬錢子苷的預測模型經3種方法篩選波段后，雖然建模變量數(shù)減少，但RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP均增大，模型預測性能下降，故選擇全光譜區(qū)間（3 999.64～9 999.10 cm?1）建模；新綠原酸、隱綠原酸及梔子苷預測模型，采用siPLS篩選波段后，建模變量數(shù)降為465個，cal、pre均增大，RMSEC、RMSECV均減小，且RSEP均減小，模型預測性能提升，故新綠原酸、隱綠原酸及梔子苷分別選擇4 601.32～4 900.23、 5 503.84～5 802.76、7 609.73～7 906.71 cm?1， 5 503.84～5 802.76、5 804.69～6 103.60、7 308.89～7 607.80 cm?1及4 300.48～4 599.39、5 203.00～5 501.92、5 804.69～6 103.60 cm?1作為最優(yōu)建模波段；固含量預測模型采用siPLS篩選波段后，雖然cal、pre略微減小，RSEP略微增大，但是RMSEC、RMSECV減小且接近，故固含量選擇4 300.48～ 4 599.39、5 503.84～5 802.76、7 008.05～7 306.96 cm?1作為最優(yōu)建模波段。

表4 不同波段篩選方法對NIRS及MIRS的影響

Table 4 Influences of different band screening methods on NIRS and MIRS spectra

質控指標光譜篩選方法ν/cm?1rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 siPLS4 300.48～4 599.39, 7 008.05～7 306.96,0.978 40.091 10.138 90.940 81.606 213 7 609.73～7 906.71 iPLS4 300.48～4 599.390.974 10.099 60.162 80.903 72.014 610 mwPLS4 387.26～4 987.020.922 70.169 70.194 30.923 91.865 78 MIRS全光譜3 000.00～648.000.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46 siPLS1 572.00～1 460.00, 1 224.00～1 112.00,0.940 60.149 60.194 30.902 42.093 712 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.886 30.205 90.244 90.826 22.743 910 mwPLS1 176.00～944.000.865 50.220 60.296 30.863 32.453 411 新綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010 siPLS4 601.32～4 900.23, 5 503.84～5 802.76,0.877 30.083 30.108 90.870 53.431 812 7 609.73～7 906.71 iPLS4 601.32～4 900.230.767 20.111 90.147 50.890 03.192 06 mwPLS6 067.60～6 676.350.673 00.128 30.145 60.762 14.545 66 MIRS全光譜3 000.00～648.000.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58 siPLS1 456.00～1 344.00, 1 340.00～1 228.00,0.800 80.103 80.121 90.738 54.661 210 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.645 40.132 70.146 70.717 24.811 18 mwPLS1 401.00～1 172.000.767 60.129 90.147 90.790 34.317 99 隱綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 siPLS5 503.84～5 802.76, 5 804.69～6 103.60,0.900 60.075 70.099 30.952 62.589 510 7 308.89～7 607.80 iPLS4 601.32～4 900.230.844 40.094 40.121 10.921 73.433 07 mwPLS4 697.75～5 297.500.872 40.085 60.169 70.855 74.340 07 MIRS全光譜3 000.00～648.000.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 siPLS1 340.00～1 228.00, 1 108.00～996.00,0.763 80.112 30.135 10.829 44.464 46 992.00～880.00 iPLS1 224.00～1 112.000.777 90.109 50.129 80.834 24.453 09 mwPLS1 412.00～1 180.000.828 70.097 20.115 20.848 44.283 211

續(xù)表4

基于MIRS，隱綠原酸預測模型經3種方法篩選波段后，雖然建模變量數(shù)減少，但cal、pre減小，RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP增大，模型預測性能下降，故選擇全光譜區(qū)間（3 000.00～648.00 cm?1）建模；綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的預測模型經采用siPLS篩選最優(yōu)波段后，建模變量數(shù)降為87個，cal、pre普遍增大，RMSEC、RMSECV較小且接近，RSEP均增大，模型預測性能提升，故綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量分別選擇1 572.00～1 460.00、 1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1， 1 572.00～1 460.00、1 340.00～1 228.00、1 108.00～996.00 cm?1，1 688.00～1 576.00、1 224.00～ 1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1及1 456.00～ 1 344.00、1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1作為最優(yōu)建模波段；新綠原酸預測模型采用mwPLS篩選最優(yōu)波段后，建模變量數(shù)降為59個，RMSEC、RMSECV較小且接近，且RSEP略微減小，模型預測性能提升，故新綠原酸選擇1 401.00～1 172.00 cm?1作為最優(yōu)建模波段。

2.8 PLS模型的建立

模型經過光譜預處理方法的選擇、最佳的潛變量數(shù)的確定及最優(yōu)建模波段的確定后，運用PLS分別建立了6個質控指標的NIRS和MIRS最佳定量校正模型，6個質控指標的NIRS模型預測效果均強于MIRS模型，故選擇6個質控指標的NIRS預測模型作為最優(yōu)模型，結果見表5。圖3為對應的6種質控指標的最佳模型的預測值與實測值的相關性。從表5可見，對于RI制劑過程的投料和二次熱處理工序的6種質控指標綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量，利用NIRS建模，其RSEP分別為1.473 4%、3.431 8%、2.589 5%、1.070 6%、2.294 6%、1.329 8%，均小于4%。而利用MIRS建模，其RSEP分別為2.093 7%、4.317 9%、4.172 6%、2.320 5%、3.816 4%、1.720 3%，均小于5%。鑒于NIRS及MIRS模型的RMSEC及RMSECV也均令人滿意，可以認為NIRS及MIRS模型均滿足實際運用的需要，可以快速有效地預測投料和二次熱處理工序的6種質控指標的含量預測。

表5 6種質控指標的最優(yōu)模型性能參數(shù)

Table 5 Optimal model performance parameters of six quality control indexes

質控指標光譜預處理方法波段篩選LVsrcalRMSECRMSECVrpreRSEP/% 綠原酸NIRSSNV全光譜120.969 90.107 20.152 50.951 91.473 4 MIRS無預處理siPLS60.940 60.149 60.194 30.902 42.093 7 新綠原酸NIRSMAsiPLS120.877 30.083 30.108 90.870 53.431 8 MIRSMAmwPLS90.767 60.129 90.147 90.790 34.317 9 隱綠原酸NIRSMAsiPLS100.900 60.075 70.099 30.952 62.589 5 MIRSMA全光譜80.830 80.096 90.145 00.870 24.172 6 梔子苷NIRS無預處理siPLS150.989 70.125 60.252 40.975 71.070 6 MIRSMAsiPLS170.966 50.218 30.324 50.888 32.320 5 斷氧化馬錢子苷NIRSSNV全光譜140.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 6 MIRSSNVsiPLS110.930 00.048 6 0.069 1 0.892 73.816 4 固含量NIRS歸一化法siPLS130.970 20.082 20.108 10.948 31.329 8 MIRS無預處理siPLS80.903 10.145 60.166 70.899 21.720 3

圖3 最佳模型中預測值與實測值的的相關性

將驗證集的光譜數(shù)據(jù)導入用已建立的最佳模型中，即NIRS預測模型。根據(jù)樣品的實測值和模型預測值，計算其相對誤差。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的模型預測值與樣本實測值的平均絕對偏差（mean absolute，MAD）及平均相對偏差（mean relative bais，MRB）見表6，結果顯示這6種質控指標的MRB均小于3.00%。

表6 驗證集樣本在NIRS預測模型中的預測值與實測值的對比

Table 6 Comparison of predicted and measured values in validation set samples

質控指標平均絕對偏差/(mg·mL?1)平均相對偏差/% 綠原酸0.114 11.20 新綠原酸0.070 82.90 隱綠原酸0.055 32.11 梔子苷0.118 10.89 斷氧化馬錢子苷0.024 81.85 固含量0.080 21.00

3 討論

本研究首次以RI制劑過程為研究對象，采用NIRS和MIRS技術，結合PLS法，經過光譜預處理方法及建模波段篩選，建立了投料和二次熱處理工序的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的定量預測模型。對比NIRS和MIRS模型對6種質控指標的預測效果，可以發(fā)現(xiàn)，NIRS模型均優(yōu)于MIRS模型，這可能與質控指標的質量濃度有關系。5種質控指標成分的平均質量濃度分別為9.851 8、2.478 3、2.740 8、13.633 5、1.302 3 mg/mL，均高于1 mg/mL，可以認為均為高質量濃度分析物，平均固含量7.995 1%亦屬于高質量分數(shù)。這與Tao等[22]的研究結果相符合，即對于高質量濃度的分析物，NIRS表現(xiàn)出比MIRS更好的預測性能。

根據(jù)平均質量濃度對6種質控指標進一步分組，將新綠原酸、隱綠原酸及斷氧化馬錢子苷分為高質量濃度組，綠原酸、梔子苷及固含量分為超高質量濃度組，以預測模型的RSEP作為決定評價指標，可以發(fā)現(xiàn)，超高質量濃度組預測模型的RSEP均小于較高質量濃度組，可以猜測，NIRS模型對高質量濃度樣品具有優(yōu)異的預測效果，并且質量濃度越高，預測效果越好，后續(xù)可以通過增大樣本量來驗證。NIRS模型與MIRS模型預測效果存在差異，也有可能是由于NIRS相較于MIRS，其波數(shù)更多，建模變量數(shù)更多，數(shù)據(jù)中包含的信息更加豐富，使得其最終模型預測效果更佳，這也需要后續(xù)的研究證明。

本研究表明，NIRS與MIRS模型都適用于這6種質控指標的預測，2種光譜技術在離線或者在線檢測方面各有所長，NIRS模型預測精度高、檢測速度快、穩(wěn)定性好[23]；MIRS建模參數(shù)少、儀器小巧便攜，而且可以適用于混懸體系樣品的檢測，減少了樣品的預處理過程，擴大了紅外光譜的應用范圍[24]，但同時MIRS對環(huán)境的要求更高，儀器位置的改變、溫濕度及壓力的變化、光纖的彎折程度等都會對光譜產生影響。與傳統(tǒng)化學分析方法相比，這2種光譜分析技術更環(huán)保，耗時更少，均可以對RI投料和二次熱處理工序的質控指標進行快速檢測，也為后續(xù)的RI制劑過程的全工序快速檢測研究奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 孫蘭, 周軍, 王振中. 熱毒寧注射液藥理作用與臨床研究進展 [J]. 中國中醫(yī)急癥, 2014, 23(12): 2247-2249.

[2] 王高舉, 焦紅軍. 基于網絡藥理學和分子對接技術的熱毒寧注射液抗SARS、MERS和COVID-19的潛在共性作用機制與活性成分研究 [J]. 藥物評價研究, 2022, 45(5): 842-852.

[3] 新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版) [J]. 中國醫(yī)藥, 2022, 17(4): 481-487.

[4] Sinelli N, Cerretani L, Egidio V D,. Application of near (NIR) infrared and mid (MIR) infrared spectroscopy as a rapid tool to classify extra virgin olive oil on the basis of fruity attribute intensity [J]., 2010, 43(1): 369-375.

[5] Urí?ková V, Sádecká J. Determination of geographical origin of alcoholic beverages using ultraviolet, visible and infrared spectroscopy: A review [J]., 2015, 148: 131-137.

[6] Nenadis N, Tsimidou M Z. Perspective of vibrational spectroscopy analytical methods in on-field/official control of olives and virgin olive oil [J]., 2017, 119(1): 1600148.

[7] 耿姝, 陳勇, 金葉, 等. 基于近紅外技術的金銀花藥材多指標成分快速檢測 [J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2016, 33(2): 144-150.

[8] 王磊, 楊越, 潘紅燁, 等. 熱毒寧注射液金銀花提取過程軌跡研究 [J]. 世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2017, 19(8): 1277-1282.

[9] 徐芳芳, 馮雙雙, 李雪珂, 等. 青蒿濃縮過程在線近紅外快速檢測模型的建立 [J]. 中草藥, 2016, 47(10): 1690-1695.

[10] 吳莎, 劉啟安, 吳亞男, 等. 近紅外光譜對熱毒寧注射液梔子萃取過程中的可行性分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2015, 21(1): 53-56.

[11] 王璇, 王永香, 畢宇安, 等. 熱毒寧注射液中金銀花和青蒿干燥工藝過程的批放行標準 [J]. 中成藥, 2017, 39(10): 2059-2063.

[12] 崔小弟, 李執(zhí)棟, 徐芳芳, 等. 熱毒寧注射液多指標成分的一測多評法同時測定 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2019, 30(5): 1116-1119.

[13] 金葉, 丁海櫻, 吳永江, 等. 近紅外光譜技術用于血必凈注射液提取過程的在線檢測研究 [J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(7): 1214-1221.

[14] 杜文俊, 劉雪松, 陶玲艷, 等. 熱毒寧注射液金銀花和青蒿(金青)醇沉過程中多指標的近紅外快速檢測 [J]. 中草藥, 2015, 46(1): 61-66.

[15] 陳奕云, 趙瑞瑛, 齊天賜, 等. 結合光譜變換和Kennard-Stone算法的水稻土全氮光譜估算模型校正集構建策略研究 [J]. 光譜學與光譜分析, 2017, 37(7): 2133-2139.

[16] 第五鵬瑤, 卞希慧, 王姿方, 等. 光譜預處理方法選擇研究 [J]. 光譜學與光譜分析, 2019, 39(9): 2800-2806.

[17] 張永超, 徐芳芳, 張欣, 等. 腰痹通膠囊4種中間體粒徑的近紅外光譜通用定量模型研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(1): 55-64.

[18] N?rgaard L, Hahn M T, Knudsen L B,. Multivariate near-infrared and Raman spectroscopic quantifications of the crystallinity of lactose in whey permeate powder [J]., 2004, 15(12): 1261-1270.

[19] 冼瑞儀, 黃富榮, 黎遠鵬, 等. 可見和近紅外透射光譜結合區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)用于橄欖油中摻雜煎炸老油的定量分析 [J]. 光譜學與光譜分析, 2016, 36(8): 2462-2467.

[20] 王彩虹, 黃林, 劉木華, 等. 基于SiPLS模型的稻殼中重金屬鉻LIBS檢測 [J]. 激光與光電子學進展, 2016, 53(11): 298-305.

[21] 史智佳, 田寒友, 鄒昊, 等. MWPLS法在羊肉中TVB-N近紅外定量分析中的應用 [J]. 食品科學, 2015, 36(20): 218-221.

[22] Tao L Y, Lin Z L, Chen J S,. Mid-infrared and near-infrared spectroscopy for rapid detection ofby a liquid-liquid extraction process [J]., 2017, 145: 1-9.

[23] 汪東升. 在線近紅外檢測系統(tǒng)的研發(fā)及在油菜籽含油率檢測中的應用 [D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學, 2020.

[24] 徐芳芳, 杜慧, 張欣, 等. 在線中紅外光譜監(jiān)測熱毒寧注射液金銀花與青蒿醇沉過程7種指標成分研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(10): 2909-2917.

Research on fast detection method of feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection preparation process by near-infrared and mid-infrared reflectance spectroscopy

TONG Feng1, XU Fang-fang2, 3, ZHANG Xin2, 3, LI Zhi-dong2, 3, WU Yun2, 3, ZHANG Chen-feng2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New Technology for Pharmaceutical Process of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China

The near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) and mid-infrared reflectance spectroscopy (MIRS) techniques were used to detect six quality control indexes in the feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection (熱毒寧注射液, RI) preparation process, so as to improve the quality control level of preparation process.The quantitative correction models of chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, gardenoside, secoxyloganin and solid content were established by using NIRS technology and attenuated total MIRS technology, combined with partial least squares (PLS) method, after spectral pretreatment method selection and band selection respectively. Calibration set correlation coefficient (cal), validation set correlation coefficient (pre), root mean square error of calibration (RMSEC), root mean square error of cross validation (RMSECV) and relative standard error of prediction (RSEP) were used as evaluation indexes to evaluate the model performance.The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the NIRS prediction model were both less than 0.3 and close to each other, and the RSEP value were all less than 4.0%. The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the MIRS prediction model were all less than 0.4 and close to each other, and the RSEP value were all less than 5.0%. These PLS models had the advantages of good model performance and high prediction accuracy.Both NIRS and MIRS technology can be used for rapid detection of six quality control indexes in RI feeding-secondary heat treatment process, and the RSEP value is within 5%, and the method is simple and reliable.

near-infrared reflectance spectroscopy; mid-infrared reflectance spectrum; Reduning Injection; preparation process; spectral pretreatment; band screening; partial least squares; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; gardenoside;secoxyloganin; solid content

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6706 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.007

2022-05-16

2022年中央財政轉移支付地方項目：基于重點研究室研究領域的中醫(yī)藥多學科研究能力提升項目——中藥提取精制新技術

童 楓（1998—），男，碩士研究生，研究方向為中藥制藥過程新技術。Tel: 18851193208 E-mail: tongfeng5324@126.com

王振中，研究員級高級工程師，碩士生導師，研究方向為中藥制藥過程新技術。E-mail: kanionlunwen@163.com

徐芳芳，女，博士，主管藥師，研究方向為中藥制藥過程新技術。E-mail: 879164331@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]