圈養雌性大熊貓發情及排卵監測方法論述及展望

楊波, 賴燕舞, 周強, 成美玲, 唐丹, 程建斌, 李果, 周應敏, 羅波, 張貴權, 黃炎*

(1. 中國大熊貓保護研究中心，四川都江堰611830；2. 大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，四川都江堰611830)

大熊貓是我國特有的孑遺物種，具有重要的學術研究價值。為了穩定與發展大熊貓種群數量，除了保護野生大熊貓的棲息地外，還應強化完善飼養管理手段，科學促進圈養大熊貓的繁殖。1963年，世界上第一只大熊貓幼仔誕生于北京動物園。成功解決圈養大熊貓繁育中的“三難”問題(張和民，王鵬彥，2003)后，圈養種群數量快速增長，截至2020年全球圈養大熊貓數量已超過600只(https://www.forestry.gov.cn/main/5904/20210102/002252617123874.html)，為野化培訓與放歸奠定了扎實基礎。大熊貓為季節性單次發情動物，一般在2—5月發情，發情配種期只有24～72 h，甚至更短。雌性大熊貓一般一年只排卵一次，有效監測排卵時間成為繁育成功的關鍵，也是圈養種群繁育的難點。國內外專家學者圍繞大熊貓發情鑒定和排卵監測進行了多學科的探討，包括行為學、細胞學、內分泌學、生物化學、微生物學、光譜化學和組織學等。本文旨在總結論述圈養雌性大熊貓發情鑒定和排卵監測的方法，并探討可能出現及應用的新方法，以期為把握大熊貓發情配種的最佳時機提供更好的參考，為大熊貓圈養種群的繁育奠定一定的理論基礎。

1 行為研究

1.1 雌性發情行為表現

國內外學者開展了大量雌性大熊貓的發情行為研究，為大熊貓的配種提供了更多、更可靠的行為數據(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；Murata.，1986；Masui.，1989；黃翔明，葉志勇，1991；Swaisgood.，2003；張和民，王鵬彥，2003；陳琳，李果，2006；楊勝林等，2007；陳超，2015；Kersey.，2016；劉敏，2016)。大熊貓的發情期分為前期、高峰期和后期(曾國慶等，1984；張和民，王鵬彥，2003)。雌性在發情期的行為表現為：前期，食欲減退，活動量增加，開始有咩叫、蹭陰、戲水、嗅氣味等行為，對雄性不感興趣或帶有攻擊行為，隨著發情繼續，減食明顯，活動量和活動時間明顯增加，戲水、咩叫和蹭陰的頻率增加，開始對雄性感興趣；高峰期，食欲大減，對雄性的反應增強并主動接近雄性，見到雄性站立不動(呆立)或用臀部頂撞雄性，翹尾，作交配姿勢，常伴有自慰行為，其中，翹尾(觸碰時或自發)是最能體現雌性愿意接受交配的行為表現(Bonney.，1982；Murata.，1986；Masui.，1989；Laura.，2002)，這也可能是一個排卵信號的行為指示(Laura.，2002)；后期，所有發情表現逐漸消失，活動量減少，食欲逐漸恢復正常。

大多數雌性與雄性進行交配的時間發生在發情高峰期，一般持續1～3 d。但某些個體發情高峰期的行為表現時間很短，僅持續1～2 h(鄧世全，陳猛，1997)，少數個體甚至未表現出明顯的發情高峰期行為。由此可見，雌性發情行為有明顯特征，對于發情行為典型的雌性大熊貓，觀察其發情行為是判斷發情程度的有效方法。

1.2 雄性發情行為表現

雄性為被動發情，當受到發情雌性求偶行為或特殊氣味刺激后才被激發(鄧世全，陳猛，1997)。雄性具有辨別雌性是否發情和是否處于發情高潮的能力，并根據雌性發情程度調節性興奮強度(李德生等，2001；張和民，王鵬彥，2003)。在雌性發情前期，雄性會表現出輕度興奮，如活動量增加、少量的標記和低頻率咩叫；當雌性處于發情高峰期時，雄性會非常興奮，不停地走動并發出頻繁的咩叫求偶聲，還時常伴有標記、戲水、尿頻等行為，喜歡舔舐雌性尿液并且跟隨和靠近雌性，有時還用前掌搔抓雌性臀部和尾部，可爬跨進行交配，某些雄性會露出陰莖(高鳳歧等，1994；鄧世全，陳猛，1997；李德生等，2001)。放對交配時，雄性爬跨雌性背部，進行“站立式”交配。陰莖插入后，將姿勢調整為“坐抱式”直到交配結束。射精時，雄性會同步雌性發出低而粗、頻率較高的咩叫。交配結束后，兩者分開，雄性停止咩叫(王雄清，1987；胡錦矗，魏輔文，1989；高鳳歧等，1994)。因此，可以根據雄性發情行為表現來辨別雌性發情程度和確定配種時機。對能進行自然交配的個體，在實踐中綜合雌性與雄性的發情行為表現，可以較直觀地判斷雌性發情程度并指導適時配種。

1.3 發情通訊行為

動物經過長期的繁殖進化已形成一種雌雄能相互識別交配行為的特殊信號。大熊貓在生活中常用化學通訊與聽覺通訊2種通訊方式(Schaller.，1985)。大熊貓的肛周腺和尿液中攜帶有關年齡、性別、社會地位和親緣關系等用于個體識別的信息(Swaisgood.，2002；White.，2004；Liu.，2006；Tian.，2007；Liu.，2008)。大熊貓的咩叫和鳥叫聲中也攜帶了關于身份、親緣關系及發情狀態等信息(北京動物園，1974；Kleiman & Peters，1990；Charlton.，2009a，2009b，2010)。大熊貓在發情時會利用嗅覺、視覺和聽覺進行交流，多模式信號(化學信號和聲音信號)是提示雌性發情程度及排卵的最佳預測器(Owen.，2016)。徐蒙等(2011)也證實了大熊貓通過標記行為做出對聲音信號(異性的叫聲)刺激的行為響應。大熊貓在求偶期間會使用多模態信號宣傳發情及生理狀況，并在更長的時間促進影響潛在的配偶(Owen.，2013)。因此，隨著雌性發情程度的遞進，雌雄個體都會交替地表現出咩叫、鳥叫和標記等行為(黃翔明，葉志勇，1991；Swaisgood.，2000；張和民等，2000；李德生等，2001)。

大熊貓在發情期擁有較為復雜的聲音類型，是性行為的一種直接表達。有6～12種聲音與發情相關，包括咩叫、鳥叫、狗吠、嗥叫、嗷嗷叫、咆哮、哼叫等(朱靖，孟智斌，1987；張和民，王鵬彥，2003；周小平等，2005；徐蒙等，2011)。其中，咩叫和鳥叫屬于非攻擊性、表達友好親近的叫聲，在交配季節可用于吸引異性和協調雌雄同步發情(Kleiman & Peters，1990)。

有關雌性大熊貓咩叫行為的研究最多，咩叫常用來鑒定雌性發情程度及判斷配種時間(北京動物園，1974；曾國慶等，1984；朱靖，孟智斌，1987；黃翔明，葉志勇，1991；邱賢猛，1993；Lindburg.，2001；Charlton.，2009a；徐蒙等，2011)。研究表明，隨著發情高峰期的到來，雌性咩叫的音調和持續時間會增加(Lindburg.，2001)；高峰期的頻率可達22～51次/10 min(曾國慶等，1984；朱靖，孟智斌，1987)或33.2～83.2次/10 min(黃翔明，葉志勇，1991)。咩叫高峰常發生在自然交配時或交配后(朱靖，孟智斌，1987；黃翔明，葉志勇，1991；邱賢猛，1993)。發情后期的咩叫明顯減少或無，頻率會下降至0～1次/10 min(曾國慶等，1984)。

雌性大熊貓的鳥叫也含有表明其發情程度的潛在信號，叫聲頻率和聲學特點可以表征其發情和排卵狀態(Charlton.，2010)。雌性會在交配前1周開始鳥叫，在交配前2 d出現峰值，直到交配后2 d都會出現較高的頻率(Zhang.，2004)。聲學分析發現，具有生育能力的雌性鳥叫持續時間較長，具有較高的抖動和刺耳性。叫聲抖動的增加可能是排卵前雌激素增加所致(Lindburg.，2001；Charlton.，2010)。Charlton等(2010)也證實了具有生育能力與不具有生育能力的雌性所發出的鳥叫存在聲學差異，雄性傾向于具有生育能力雌性所發出的鳥叫。因此，雌性發出高頻率的叫聲可能是為了吸引雄性，引起雄性產生強烈性欲并與其順利完成交配。因此也可將鳥叫視為雌性處于發情高峰或排卵期的重要信號。

除了叫聲行為以外，標記也是一種通訊方式。雌性大熊貓的化學信號主要通過蹭陰(尿液或肛周腺分泌物標記)的方式傳播。蹭陰遺留物中含有大量用于生殖聯系的氣味信息，能夠促使雌、雄生理與發情行為同步，作交配前準備。因此，雌性會通過蹭陰來預示其發情期的到來，以達到吸引雄性的目的。雌性蹭陰主要發生在交配前，高峰期一般發生在咩叫高峰期前，頻率可達60～106次/100 min(黃翔明，葉志勇，1991)。隨著發情遞進，蹭陰頻率逐漸增加，在交配發生前的1～5 d達到頂峰，而雌性很少會在交配時或交配后再發生該行為(Murata.，1986；Lindburg.，2001；Laura.，2002；Swaisgood.，2003；Zhang.，2004)。

從前人研究成果及實踐應用中發現，量化叫聲和標記行為，根據叫聲或行為的頻率強度來推測及判斷雌性的發情高峰期或排卵時間。但目前存在研究個體不足、數據量偏少、研究結果有偏差和個體差異性等現狀，不足以建立一個較為精確的評估標準，值得深入研究。

2 外陰形態及陰道細胞學研究

2.1 外陰形態

雌性外陰(外生殖器官)形態會在發情期發生特殊性變化，與發情程度存在關聯性。雌性外陰的顏色、水腫程度及開口大小是主要的發情鑒定指標。綜合相關文獻(邱賢猛，1987，1988；施少清等，1988；Durrant.，2003；陳琳，李果，2006；周應敏等，2013，2020；劉敏，2016)得出：雌性在發情前期，外陰呈粉紅色或淺紅，外翻及開口程度小；隨著發情繼續，色紅而潮潤，陰門開始紅腫并逐漸顯著，陰道黏膜腫脹，開口逐漸張至最大；發情高峰期，色呈玫瑰紅，陰道黏膜腫脹但松弛，開口外翻程度有開始變小的趨勢，有分泌物流出；發情后期，紅色褪去偏白，陰門紅腫消失，開始回收、縮小。將雌性外陰形態與發情行為結合來判斷大多數圈養雌性大熊貓斷發情程度或選擇配種時間仍然是一個簡捷而有效的方法。

2.2 陰道細胞

湯純香等(2000)描述了雌性大熊貓陰道細胞(文中所稱“陰道”實際為“尿生殖前庭”)的形態學變化：非發情期的細胞呈深藍色，細胞與細胞核均很小；發情前期的細胞呈藍色而略帶粉紅，細胞核仍很小。隨著發情發展，細胞大多數呈粉紅色，多邊形，細胞與細胞核開始膨大漸至破裂；發情高峰期的細胞大多數呈橙黃色，細胞角質化，細胞核消失，呈多邊形且很薄。Durrant等(2002，2003)利用巴氏染色法染色陰道細胞后得出：在排卵前 8～9 d，大部分脫落的陰道細胞由嗜堿性(藍色)轉變為嗜酸性(粉紅色)，沒有伴隨核或細胞質變化；排卵前2 d，大多數陰道細胞由角質化(橙色)細胞取代嗜酸細胞。

陰道細胞在發情期會角質化，而且細胞角化率會隨著發情程度的推移呈現出同步增長的趨勢。因此，陰道細胞角化率對大熊貓發情鑒定及配種時機確定具有良好的指示性，在早期大熊貓生產中得到過很好的驗證和應用(潘秀森等，1984；陳玉村等，1985；邱賢猛，1987，1988，1993；陳猛等，1998；湯純香等，2000；Durrant.，2002，2003)。在發情期多數雌性大熊貓的陰道細胞角化率會從非發情期的35%以下(湯純香等，2000)，上升至60%及以上(陳猛等，1998；湯純香等，2000)。在發情高峰期或自然交配時，陰道細胞角化率最高，上升至70%及以上，有的甚至可達97%(邱賢猛，1987，1988，1993；陳猛等，1998；湯純香等，2000；Durrant.，2002)。但陰道細胞角化率分析存在個體差異，有報道顯示最高角化率只有55%左右(潘秀森等，1984；鄧世全，陳猛，1997)，甚至還有 1例異常：發情個體在整個發情期的角化率并未發生變化，均小于20%(周應敏等，2013)。不僅如此，上述研究中的采樣頻率為每日一次，這或許能夠滿足參與自然交配個體的配種，但這樣的采樣頻率在人工授精(artificial insemination，AI)中偏低。

通過外陰形態變化和陰道上皮細胞角化率，能判斷雌性大熊貓的發情程度，但外陰形態的判斷很大程度依賴觀察者的經驗，陰道上皮細胞角化率監測也受限于較為困難的頻繁采樣。因此，這2種判斷方法在繁殖生產中有效，但在應用上會受到一定程度的限制。

3 內分泌

3.1 類固醇性激素

類固醇性激素與動物繁殖密切相關，性激素的變化對生殖系統的活動具有調控作用，性激素水平可以反映出性腺的活動規律及繁育狀態(Lasley & Kirkpatrick，1991)。目前對發情期雌性大熊貓的類固醇性激素研究集中于雌性激素：雌酮-3-葡萄糖醛酸苷(E1G)、雌酮-3-硫酸鹽、17β-雌二醇以及雌三醇(李復東等，1993；Laura.，2002；Narushima.，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)和孕激素：孕酮、孕二醇-3-葡萄糖苷酸(Monfort.，1989；彭世媛，葉志勇，1993；Narushima.，2003；Hama.，2009)。早期主要利用放射免疫測定法(radio immunoassay，RIA)測定大熊貓血清及尿液中性激素水平(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；李復東等，1993；謝鐘等，1994；Lindburg.，2001；Narushima.，2003；Owen.，2005；MacDonald.，2006)。RIA的局限性在于：使用放射性元素，不僅對實驗人員及環境產生一定的危害，而且對實驗室及實驗人員的要求較高，價格較昂貴(鄧濤等，2013)。酶聯免疫分析法(ELISA)逐漸替代RIA，且研究也證實了ELISA與RIA所得出的結果存在一致性(黃炎等，2001)。因此，ELISA被廣泛應用到大熊貓尿液、糞便、毛發等非損傷性樣品的類固醇性激素水平測定中，尤其被應用在大熊貓尿液類固醇性激素水平的測定，為大熊貓發情配種及排卵監測提供了可靠的技術支持(彭世媛，葉志勇，1993；黃炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；劉敏，2016；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)。

在雌性大熊貓發情期，無論是血清中雌激素水平還是尿液中雌激素代謝產物含量均呈現出“緩升快降”的變化，即雌激素隨著發情開始從基礎水平緩慢上升，直到峰值的出現，隨后劇降至基礎水平(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；施少清等，1988；彭世媛，葉志勇，1993；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；沈潔娜等，2020)。雌激素對發情行為具有觸發作用，且雌激素在排卵前似乎能夠很好地預測發情行為(Chaudhuri.，1988；Lindburg.，2001；Hama.，2009)。雌性發情高峰期發生在雌激素峰值出現的前1 d、當日或激素峰后第1天，最高的配種率均發生在雌激素峰后(Bonney.，1982；Monfort.，1989；彭世媛，葉志勇，1993；馮文和等，1994；Lindburg.，2001；董武子，竇忠英，2003；Czekala.，2003；楊勝林等，2007；Huang.，2012a；劉敏，2016；沈潔娜等，2020)。雌性大熊貓的自然交配或AI時間應控制在雌激素峰出現的當日或之后的第1～3天(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾國慶等，1990；李復東等，1993；彭世媛，葉志勇，1993；謝鐘等，1994；董武子，竇忠英，2003；Czekala.，2003；楊勝林等，2007；Huang.，2012a，2012b)。

除此以外，孕激素從雌性發情開始一直處于最低水平，在雌激素峰前或峰后開始上升，隨后保持在一個較高的水平，直到產仔后才降至基礎水平(曾國慶，劉維新，1994；Laura.，2002；Kersey.，2010；沈潔娜等，2020)。因此配種時間應選擇在雌激素下降且孕激素逐步升高期間(李復東等，1993；沈潔娜等，2020)。有研究指出，大熊貓在排卵后孕激素的分泌量會大量增加(Monfort.，1989)。雌激素峰后第7天的孕激素水平是基礎水平的4倍，孕激素水平可作為確定排卵的方法(Czekala.，2003)。

雌激素和孕激素的變化趨勢只能明確大熊貓的排卵發生在雌激素峰后和孕激素上升的這段時間，但不能確定排卵與雌激素峰發生的時間關系(Lindburg.，2001)，或許可以通過配種時間與受孕情況的相關性來探討。喻述容等(2003)根據成都大熊貓繁育研究基地1997—2001年39例大熊貓繁殖情況，得出雌激素峰后12 h內進行首次自然交配、AI或混合配種，受孕率達100%；峰后12～24 h，受孕率為83.3%；峰值下降24 h后，受孕率為0。根據中國大熊貓保護研究中心2017年繁育情況總結得出：雌激素峰后12 h內，受孕率為84.6%(=13)；峰后12～24 h，受孕率為75%(=8)；峰值下降24 h后(≤37.8 h)，受孕率為85.7%(=7)(內部資料)。大熊貓的生育窗口期定義為雌激素峰值后的48 h內，在此期間需要進行自然交配和/或AI 1次或2次(Kersey.，2016)。侯蓉等(2012)報道在雌激素真實峰出現后24～48 h內進行首次AI，完成后6～8 h進行第二次AI，妊娠率可達42.11%。Huang等(2012a)在2004—2010年對 14只成年雌性進行AI，首次在雌激素峰值當天，受孕率為75%，在峰后第1天內的受孕率為29%，超過1 d的受孕率為0，整體為25%。沈潔娜等(2020)也報道首次AI平均時間為雌激素峰后29.8 h的受孕率高達46.7%(=16)。

雌激素可以直接反映卵泡發育程度，且不易受外界因素影響，其監測較為準確、穩定。雌激素監測在大熊貓發情配種實踐中得到廣泛應用，并獲得了較好的監測效果。該方法促使自然交配的受孕率達75%以上，AI的受孕率在25%以上，甚至有接近50%的受孕率。目前國內外研究機構均將雌激素峰發生時間作為定義大熊貓生育窗口期的主導時間指標，并將該方法應用于指導適時配種。

3.2 促黃體生成素(LH)與促卵泡激素(FSH)

LH與FSH均是由腦垂體前葉嗜堿性細胞分泌的糖蛋白激素，受下丘腦促性腺激素釋放激素控制，同時也受卵巢的正負反饋調控。LH對卵泡發育成熟和卵母細胞發育潛力獲得具有重要作用。FSH可促進卵泡顆粒層細胞增生分化，并促進卵巢發育。LH和FSH是調控卵泡生長的主要激素。類固醇性激素的產生依賴LH和FSH的協同作用，卵子的成熟和排出與LH 密切相關。

早期有學者利用生物測定法(施少清等，1988；曾國慶等，1990)和碘標人類LH雙抗法(林增云，1991)測定大熊貓LH含量。分析得出，血清LH峰與血清雌激素峰出現在同一天或者后1～2 d，而尿液LH峰與血清LH峰在同一天或后1 d出現(施少清等，1988；曾國慶等，1990)，尿液LH峰與尿液雌激素峰在同一天(施少清等，1988；林增云，1991；周杰瓏等，2007)或后 1～2 d出現(曾國慶等，1990；周杰瓏等，2007)。綜上，LH峰在雌激素峰后發生，并且在雌激素峰出現的當日或峰后1～2 d發生。

隨著ELISA的研發，LH的測定更方便、快捷。蔡志剛等(2010)利用與大熊貓同源最高動物的商業化ELISA試劑盒測定大熊貓尿液LH，發現LH峰與雌激素峰相差±8 h(產仔個體=4)，或者LH峰在雌激素峰后15～26 h出現(非產仔個體=2)。蔡開來等(2016)發明大熊貓LH檢測試劑盒并提供了檢測方法，通過尿液LH檢測可以實現對大熊貓發情及排卵的監測。隨后，Cai等(2017)發現大熊貓個體間LH峰和雌激素峰的間隔時間不同，但尿液LH峰總是在雌激素峰之后出現，大多數產仔雌性在LH峰后10 h內(受孕率為85.71%)或10～28 h(受孕率為33.33%)進行首次AI，尿液LH峰出現在雌激素峰后11.2 h±5.4 h(懷孕組)和14.8 h±7.4 h(非懷孕組)，LH大量分泌標志著排卵的發生，LH峰出現時間最適宜進行自然交配或AI。

測定發情期雌性大熊貓尿液FSH含量發現，從基礎值到峰值的間隔期約10 d，此持續時間即為大熊貓的卵泡期(約10 d)；同時，尿液FSH峰與尿液雌激素峰出現的時間一致(Monfort.，1989)。

與大熊貓類固醇性激素研究相比，LH與FSH的研究和報道較少、深度與廣度不夠，但在未來有很大的應用前景，需要繼續研究。

4 生化分析

繁殖季節大熊貓肛周腺及尿液中很可能含有觸發生殖行為或與生殖有關的揮發性物質。劉定震等(2003)利用氣相色譜-質譜聯用技術檢測大熊貓尿液中揮發與半揮發性物質，發現性活躍的雄性尿液中含有更多揮發性強、相對分子質量小的酸性物質，在整個繁殖期的揮發性成分較非繁殖期多。發情期雌性尿液中的中鏈脂肪酸含量隨雌激素增加而增加(Dehnhard.，2006)。進一步研究發現，雌性尿液中癸酸含量隨雌激素升高而顯著上升，進而激發雌性的發情行為，表明該物質可能作為一種信息素來讓雌性吸引雄性，在排卵前會及時釋放(Dehnhard.，2016)。

劉俊英等(2000)已證實氣相色譜-質譜聯用技術也可以被應用于大熊貓肛周腺性外激素的檢測。郭俊良(2020)研究顯示，發情期雌性肛周腺分泌物中含有122種化合物，其中2種脂肪酸酯(ethyl oleate和ethyl9-hexadecenoate)呈現出顯著差異性，并隨著發情的推進顯著增加，表明這2種化合物可能是雌性大熊貓處于發情期特殊信號物，與發情狀態存在一定的關聯性。

大熊貓體液(尿液和肛周腺)生化的研究進展較緩慢，研究深度不夠，無法建立標準化的評估體系，且測試時間較長、費用較高。目前尚不能直接應用在大熊貓適時配種上，但在大熊貓繁殖生理學研究中起著重要的作用，需要進一步研究。

5 微生物

生殖道內的微生態系統是維持生殖道內穩態以及抵御外來有害病原重要的非特異性免疫系統，可以有效防御生殖道感染。雌性大熊貓的生殖道感染會引起繁殖障礙，甚至流產。早期已有學者對非發情狀態下雌性大熊貓生殖道內的菌落結構做了探究(雷蕾等，2001；胡國全等，2005)。劉燕等(2012)發現，在發情高峰期AI時陰道黏液中的鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和大腸桿菌為主要菌群。馬曉平等(2016a，2016b)在發情期雌性陰道分泌物中獲得并鑒定出18株產HO的乳酸菌和30種真菌(包含25種霉菌和5種酵母菌)。近期也有研究表明，隨著發情繼續，雌性肛周腺中未分類假單胞菌屬__和彎曲桿菌屬等菌落的豐富度明顯增加，而考克氏菌屬、短狀桿菌屬、短桿菌屬及葡萄球菌屬等菌落的豐富度降低，推測發情期雌性會通過增加假單胞菌等和降低短桿菌、短狀桿菌豐富度的方式，以增加固醇類及脂肪酸酯類化合物的合成，進而釋放出發情期的氣味信號，有利于增加與異性的交流機會，達到發情配種的目的(郭俊良，2020)。微生物學方面的研究重點在于探討大熊貓發情期生殖道內微生物群落特性，進一步證實微生物會參與大熊貓發情期某些化合物的合成，并揭示了特定微生物群落在發情期雌性大熊貓化學通訊中的作用。但微生物學研究與大熊貓發情評估及排卵監測的關聯度較低，不具備指導適時配種的能力。

6 光譜化學

Kinoshita等(2012)利用近紅外光譜對3只發情周期個體進行相關分析，發現雌性發情狀態與尿液中氫鍵水結構的增加有關；水帶內的E1G標準濃度與雌激素水平有較高的相關性；在E1G峰值前后即排卵前后，尿樣中強氫鍵水(S2、S3、S4)水平升高，弱氫鍵水(S0、S1)水平下降。近紅外光譜可用于快速、無創地檢測雌性發情程度。該檢測方法或許開辟了一個新的監測領域，為大熊貓的發情配種提供了新的技術支持。但樣品量少，未來需要進一步調查，以完善這一新方法。

7 其他方法學研究

Wallach等(1980)報道了6只大熊貓在發情時陰道黏液分泌量最多可達15 mL，pH5.5～6.5,同時黏液中NaCl含量會增加，從而引起電阻值的改變。李惠福等(1983)、朱本仁和陳遠飛(1987)對 8只個體的11個發情周期進行研究，發現尿液中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在發情期的特異性變化與性行為高峰密切相關，且其第一峰與大部分雌性的行為高峰期吻合。侯蓉等(1998)發現4只正常發情大熊貓的陰道黏液電阻值會呈現出“V”形曲線，且其低谷值與尿液雌激素峰值對應，配種可控制在電阻值回升時進行。除此以外，劉玉良等(2009)在10只個體的 23個發情周期中發現，宮頸黏液(麻醉采集)結晶在發情前期呈水草狀，排卵期(雌激素峰后0～1 d)呈典型的羊齒狀，排卵后的第2天消失。宮頸黏液中呈現出典型的羊齒狀結晶可能是判斷雌性排卵的一個參考指標，而在雌性唾液里同樣也發現了該現象(劉玉良等，2009；王無雙等，2013)。但現有研究中的個體數偏少、研究深度不夠、個體差異較大，甚至需要麻醉操作，宮頸黏液的生理學分析對大熊貓適時配種的應用有待進一步驗證。在今后或許可以加強唾液生理學分析的深度與廣度，以替代宮頸黏液用于發情鑒定與排卵監測。

除上述方法外，雌性大熊貓在發情期的基礎體溫(38.2～38.8 ℃)比正常體溫(非發情期體溫，36.5～37.5 ℃)高1 ℃以上，并在發情期前和發情后期出現低于正常體溫的現象(陳玉村，陳玉華，1983；陳玉村等，1985)。邱賢猛(1987)發現發情期雌性陰道黏膜層組織切片比非發情期厚10～15倍。邱賢猛(1988)進一步發現，隨著體內雌激素水平的升高，雌性大熊貓陰道復層扁平上皮的中層細胞大量增生，發情個體的陰道復層扁平(鱗狀)上皮比非發情個體厚7～14倍。

綜上所述，基礎體溫監測法與組織學分析僅能用于判斷大熊貓是否處于發情期，而無法確定發情程度，更不能判斷排卵時間，不足以指導大熊貓適時配種。發情期的體溫監測在操作上也存在較大的難度。陰道活組織切片技術會對機體造成損傷，不提倡該方法的大量應用。

8 總結及討論

國內外研究者在大熊貓發情配種及排卵監測上開展了大量的科學試驗及應用實踐工作，本文論述了正在使用的監測方法和評判標準。研究結果表明每種方法各有利弊，其指導實踐的成效也各有不同。這種差異性歸因于發情期及排卵期的生理反應在細胞、組織、器官及系統中的響應時間不同，以及各檢測方法的靈敏度及準確性不同。

大量實踐證實，行為和外陰觀察法是判定大熊貓發情程度最易操作且直觀的方法。但此方法易受觀察者的經驗及其他主觀因素的影響，缺少穩定性。對于發情行為典型的雌性大熊貓，依靠這2種方法能較準確地判斷和確定其配種時機。但對發情行為較隱蔽的個體，此方法的效能不足。除了行為觀察法外，陰道上皮細胞角化率也是早期較常用的監測手段，但也存在個體差異性、發情高峰期樣品不易收集、采樣時會對雌性造成不同程度的外在刺激等問題，最終使得檢測的準確性和時效性降低。若在沒有其他監測手段(如激素監測)的情況下，陰道上皮細胞角化率監測仍是不錯的選擇，可以同時結合行為和外陰形態判斷大熊貓的配種時機。

ELISA試劑盒的商業化及不斷改進，可以有效地測定大熊貓尿液、糞便等非損傷性樣品中的激素水平，從而避免麻醉、采血等應激刺激對大熊貓繁殖機能的不利影響。同時ELISA兼具實驗條件簡單、操作便捷、價格不高、檢測時間較短(2～3 h)等特點。利用ELISA測定大熊貓雌激素水平在人工繁育中得到有效應用，目前雌激素監測被證明是確定自然交配或AI時間最準確的方法(彭世媛，葉志勇，1993；黃炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；劉敏，2016；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)。

綜合前人研究(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾國慶等，1990；李復東等，1993；彭世媛，葉志勇，1993；謝鐘等，1994；Czekala.，2003；董武子，竇忠英，2003；Kersey.，2006；楊勝林等，2007；Huang.，2012a，2012b)，自然交配時間應控制在雌激素峰出現的當天或峰后1～3 d內；AI控制在雌激素峰后48 h內進行1次或2次。由于以上的大部分研究數據僅基于每日1次的采樣頻率，對于雌激素真實峰發生時間的判斷會出現較大偏差，進而影響到配種時間的精準確定，導致分析結果差異。因此，為了確定尿液中雌激素真實峰的發生時間，應將尿液采集頻率控制在3～6 h采樣1次。結合雌激素與受孕率的關系(周杰瓏等，2007；Huang.，2012a；侯蓉等，2012；Cai.，2017；沈潔娜等，2020)，自然交配控制在雌激素峰后36 h內進行1～2次；首次AI時間在雌激素峰后12 h內，12～24 h后進行第2次。若首次AI時間在峰后12～24 h，則6～12 h后進行第2次。

LH大量分泌標志著排卵即將發生，理論上LH峰出現時間是最適宜進行自然交配或AI。但由于大熊貓LH的ELISA試劑盒的商業化還在進行中，現階段無法普及應用，數據量也還需進一步積累以進行更多的實踐驗證。而其他監測方法，如生化分析、微生物學分析、光譜化學分析、組織學分析、基礎體溫監測、宮頸黏液生理學分析等，由于研究關聯度低、數據少、采樣困難、費用較高、試驗時間較長、方法不夠成熟等，對大熊貓繁殖生產實踐的指導意義不大，可作基礎性研究。

綜上所述，行為監測、外陰評估、雌激素監測和陰道細胞角化率是較有效的雌性大熊貓發情程度鑒定及排卵監測的方法，尤其是前三者更為常用。各繁育機構可根據自身實際條件選擇其中一種或多種，建立切實有效的發情監測體系，比如：以雌激素為主，行為、外陰為輔的評估體系；或行為、外陰與陰道細胞角化率三者共同評估的體系。其他監測方法需進一步完善。

9 展望

在人類和其他哺乳動物上發現，發情期宮頸黏液中酶、蛋白質及碳水化物等物質均存在生理性的變化(王紅等，1994；曹纘孫，1995；杜小麗，趙青云，1996)。根據宮頸黏液物理特性和化學組分隨卵巢激素分泌變化而出現周期改變的特點，宮頸黏液評分應用于評價卵巢功能和預測排卵具有可行性(曹纘孫，1995)，因此未來大熊貓宮頸黏液評分的應用對發情鑒定、排卵判斷和卵巢功能評估或許具有較為可行的參考價值。此外，可以利用影像技術(B超或腹腔鏡)監測發情期大熊貓卵巢狀態，找到卵泡發育與性激素水平的協同關系，以此推測排卵時間。從目前大熊貓發情鑒定和排卵監測方法的研究進展來看，生殖內分泌學和醫學影像學是今后研究新監測方法的主要領域。