基于正交設計結合G1-熵權法優選溫經膏的制備工藝研究

陶葉琴，牛江進，謝宗明，袁 淼，熊 丹，蔣翠平

（瀏陽市中醫醫院，湖南 瀏陽 410300）

溫經湯出自張仲景《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》，臨床上多采用其加減方治療原發性痛經[1-3]。溫經湯是婦科調經之要方，臨床應用廣泛，具有很好的開發價值。“溫經膏”處方是以溫經湯為基礎方加減而來，由當歸、川芎、牡丹皮、吳茱萸、阿膠等藥材組成，具有溫經散寒、養血祛瘀、補益天癸、調暢氣血的攻效，用于女性沖任虛寒兼有瘀滯者。該品種已在我院廣泛使用多年。為了能更好地服務臨床，此次開發煎膏劑，并采用單劑量包裝，這樣不僅保留了原方的特點和優勢，而且方便了患者的用藥以及確保服用劑量的準確、可控。合理的工藝設計是保障中藥質量的關鍵。如何最大限度地提取和保留溫經膏臨床起效物質是本試驗提取工藝的關鍵因素。

溫經湯藥味較多，成分復雜多樣，為確保制劑工藝的精制有效，選取多個指標成分同時優化工藝參數，而多指標的權重賦予是綜合評分科學合理的直接體現，是優選提取工藝和保證中藥質量和療效的關鍵。G1-熵權法是一種主觀賦權法和客觀賦權法相結合的方法，既可避免人為賦權過于主觀，又可避免試驗數據出現誤差后所導致綜合評價結果出現的較大偏差[4-7]。正交設計與G1-熵權組合賦權法相結合，能提高所得試驗結果的科學性與嚴謹性，使優選出的工藝更具合理性及可行性[8]。因此，本試驗將正交設計與G1-熵權組合賦權法相結合對溫經膏的提取工藝進行優化，并對其濃縮工藝和成型工藝進行研究，為該制劑的工業化生產及質量標準研究奠定基礎。

1 材 料

1.1 儀器LC-10AT型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；L5S型紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；BS224S-CW型電子天平（德國賽多利斯）；CH-0.1AM型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GENIUS4K型低速離心機（長沙鑫奧儀器儀表有限公司）；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥當歸、川芎、牡丹皮、吳茱萸、阿膠等19味藥材，其中阿膠來源于湖南東健藥業有限公司，其他18味藥材均購自湖南省金實堂中藥飲片有限公司，經瀏陽市中醫醫院謝宗明主任中藥師鑒定為正品，符合2020年版《中華人民共和國藥典》一部有關規定。丹皮酚（批號：110796-201136，純度：99.8%）、阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.7%）、蔗糖均購自湖南九典宏陽制藥有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自德國默克股份有限公司；其他試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸、丹皮酚含量測定

2.1.1 色譜條件[9-12]采用InertsilODS-3C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相（阿魏酸含量測定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，88%A→85%A，10～20 min，85%A→84%A，20～60 min，84%A→35%A，60～65 min，35%A→88%A，65～70 min，88%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。流動相（丹皮酚含量測定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～25 min，95%A→78%A，25～35 min，78%A→70%A，35～45 min，70%A→40%A，45～60 min，40%A→20%A，60～66 min，20%A→95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：274 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；分離度＞1.5。色譜圖見圖1～2。

圖1 阿魏酸對照品（A）、供試品（B）、缺當歸、川芎的陰性對照（C）HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸10.20 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用70%色譜甲醇溶解定容至25 mL，即得阿魏酸對照品溶液；精密稱取經P2O5干燥器干燥24 h的丹皮酚對照品10.14mg置于25mL容量瓶中，用50%色譜甲醇定容至25mL，即得丹皮酚對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別吸取正交試驗項目下9組供試樣品各5 mL，置于10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，吸取上層清液過0.22 μm的微孔濾膜，得供試品溶液。取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 分別按溫經膏處方的配比精密稱定除當歸和川芎、牡丹皮的處方，按溫經膏的提取方法和“2.1.3”項下供試品溶液的處理方法，分別制得缺當歸和缺川芎的陰性對照溶液、缺牡丹皮的陰性對照溶液。

圖2 丹皮酚對照品（A）、供試品（B）、缺牡丹皮的陰性對照（C）HPLC圖

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取上述對照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL置于10 mL容量瓶中，丹皮酚對照品溶液用50%甲醇稀釋至相應濃度；阿魏酸對照品溶液用70%甲醇稀釋至相應濃度，搖勻，按“2.1.1”項下條件進樣測定，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），計算回歸方程為：阿魏酸Y=126 633X+48 302，r=0.999 8；丹皮酚Y=10639X+6 785.7，r=0.999 9，結果表明阿魏酸、丹皮酚分別在10.68～213.6、10.14～243.36 μg/mL的范圍內線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 分別取阿魏酸、丹皮酚對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為0.92%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取溫經膏水提供試品溶液分別于制備后0、3、6、9、12、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為0.74%、0.83%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗 平行制備6份溫經膏水提供試品溶液，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為1.97%、1.34%，結果表明方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取含量已知的供試品水提溶液6份，每份1 mL，分別精密加入對照品溶液1 mL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，阿魏酸、丹皮酚平均加樣回收率分別為97.83%、99.67%，RSD值分別為1.71%、0.56%。表明方法準確性良好。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結果

2.1.10 樣品測定 取待測供試品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄阿魏酸和丹皮酚的色譜峰面積，分別代入“2.1.5”項下的回歸方程計算各成分在供試品中的質量濃度，并以對應藥材量計算阿魏酸和丹皮酚在供試品中的含量。

2.2 干膏率的測定精密吸取已定容的提取液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃條件下干燥3 h，置于干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定，至兩次質量差異不超過0.3mg，記錄各樣品液的干膏質量，按以下公式計算干浸膏得率。

注：W.干浸膏質量（g）；W1.藥材取樣量（g）；V.定容體積（mL）

2.3 評價指標的組合賦權

2.3.1 G1法主觀賦權[13-14]建立評價指標y1，y2，…ym，確定各評價指標的序關系，記為y1＞y2＞…ym（相對于某評價目標的序關系）。根據實際情況及參考文獻得出相鄰2個準則層yk-1與y重要性程度之比rk的理性賦值。確定了rk的理性賦值后，權重系數wk的計算，見公式（1）。

2.3.2 熵權法客觀賦權[15-16]熵權法是一種根據各項指標觀測值來確定指標權重的方法。熵用來度量系統混亂程度或無序程度，如果指標的熵值越小，則它所包含的信息越多，在綜合評分中所占的比重越大，操作如下：

第一步：原始數據矩陣歸一化。歸一化后得到屬性矩陣R=（rij）n×m（m表示評價指標個數、n表示評價對象個數），進行歸一化，見公式（2）。

yij表示第i個評價對象的第j項指標數值；yjmax、yjmin分別是yij的最大和最小值；i為1，2，…，n；j為1，2，…，m。

第二步：求指標熵值。

第三步：計算指標權重系數。

2.3.3 組合權重的確定[9]用w1、w2分別表示G1法得到的主觀權重，熵權法得到的客觀權重，組合權重計算公式為（5）。

2.4 提取工藝研究

2.4.1 浸泡時間考察[17-18]浸泡時間的長短是影響提取效果的因素之一，中藥飲片煎煮前適宜的浸泡能夠讓藥材吸水至飽和狀態，有利于有效成分的溶出，但浸泡時間過長則易導致藥材霉敗，化學成分酶解等不良影響。現將吸水率作為考察指標,通過單因素試驗對浸泡時間進行考察。

（1）試驗方法：按處方配比稱取藥材（182 g）9份，置于3 000 mL燒杯中，各加10倍量水沒過藥材，密閉，室溫放置。分別浸泡10、15、20、30、40、50、60、70、80 min后，紗布過濾，測量濾液體積，按下式計算各時間點藥材的吸水率。

（2）試驗結果：藥材在30 min以后的吸水率無明顯變化，說明藥材此時吸水已經達到飽和，從生產實際出發，既要充分浸泡，又要節省時間，因此最終確定藥材浸泡時間為30 min。（見表2）

表2 浸泡時間考察試驗結果

2.4.2 正交試驗設計 按處方配比稱取組方182 g，共9份，以加水倍量、提取時間、提取次數為考察因素，以阿魏酸、丹皮酚提取量及浸膏得率為評價指標，采用L9（34）正交設計優選溫經膏的水提工藝參數，因素水平見表3。

表3 因素水平表

根據處方的君、臣、佐、使配伍原則，用G1法來確定3個評價指標的重要關系為阿魏酸提取量＞丹皮酚提取量＞浸膏得率，并確定各指標的權重評價標度，其中r2=1.2，r3=1.4。根據r2、r3得到各指標的主觀權重值w1。根據提取工藝的試驗結果，選取熵權法計算各指標的客觀權重值w2。最后根據公式（5）來計算組合權重值（W），并計算9組試驗的指標綜合評分Pj，并進行統計學分析。組合權重結果見表4。

表4 評價指標權重值

直觀分析結果如表5，方差分析結果見表6，Pj計算公式為公式（6）。

表5 試驗設計及結果

表6 方差分析

結果表明，各因素對試驗結果綜合評分的作用主次為B＞C＞A，其中B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，A2＞A3＞A1；由方差分析可知，在α=0.05時，因素B（提取時間）對試驗結果的綜合評分有顯著性影響，其他兩個因素均無顯著性影響。綜合生產實際和保證臨床療效，最終選取A2B3C2為最佳提取工藝，即共提取2次，第一次加10倍量的水，提取2h，第二次加8倍量的水，提取1.5h。

2.4.3 驗證試驗 根據優選的提取工藝A2B3C2，進行了3次驗證試驗，其綜合評分分別為97.91、99.90、98.57；x=98.79，RSD=0.84%，3批數據無顯著性差異，結果表明優選的水提工藝參數穩定、合理可行。

2.5 濃縮工藝考察

2.5.1 濃縮方式考察 稱取6個處方量的藥材，按上述已經優選的提取工藝進行提取，提取液分成等量的6份，其中3份采用常壓濃縮；另外3份采用減壓濃縮（溫度70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）。在濃縮至相對密度約為1.25（60℃）時取樣檢測，結果見表7。綜合評分=丹皮酚含量/丹皮酚含量最大值×1/3×100+阿魏酸含量/阿魏酸含量最大值×2/3×100。

表7 濃縮工藝中濃縮方式考察結果（n=3）

試驗結果表明，濃縮方法對阿魏酸和丹皮酚含量影響均較大，其中減壓濃縮優于常壓濃縮，所以參考綜合評分的結果，最終采用減壓濃縮（溫度為70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）作為溫經膏的濃縮方法。

2.5.2 濃縮溫度考察 按處方配比稱取12份樣品，按優選的最佳提取工藝，參考實際生產情況，分別考察60℃、70℃、80℃、90℃減壓濃縮溫度對溫經膏中指標性成分阿魏酸和丹皮酚的含量影響情況。結果表明，阿魏酸在70℃減壓濃縮時，含量最高；丹皮酚在60℃減壓濃縮時，含量最高。根據綜合評分，阿魏酸、丹皮酚的綜合評分在70℃含量最高。結果表明70℃是最優減壓濃縮溫度。（見表8）

表8 濃縮工藝中濃縮溫度考察結果（n=3）

2.6 成型工藝研究取制備好的浸膏30 g共5份，按表8加入不同配比的煉糖，不斷攪拌，繼續加熱，再按處方配比加入烊化后的阿膠，混勻，收膏。分別取一定量品嘗，觀察狀態并按2020年版《中華人民共和國藥典》項下方法檢測不溶物和相對密度。結果見表9。

表9 煉糖用量考察試驗結果表

結果表明，當m（煉糖）∶m（清膏）=1.5∶1和2∶1時，口感改善均較明顯，考慮到盡可能減少輔料用量，降低服用量，又利于成型，最終選擇m（煉糖）∶m（清膏）=1.5∶1。此時成品的口感較好，黏稠度適中，不溶物符合規定，相對密度為1.342（60℃），根據前期經驗，該密度既能滿足煎膏劑要求，其流動性又能滿足包裝設備要求。另外，根據2020年版《中華人民共和國藥典》四部規定，煎膏劑加煉糖的量，要求不超過清膏量的3倍，本工藝加入煉糖的量僅為清膏量的1.5倍，符合藥典要求。

2.7 含量測定色譜條件同“2.1.1”項，溶液制備同“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項，線性關系考察同“2.1.5”項方法，精密度試驗“2.1.6”項方法，穩定性試驗同“2.1.7”項方法，重復性試驗同“2.1.8”項方法，加樣回收率試驗同“2.1.9”項方法。取3批溫經膏，進行含量測定，結果見表10。3批成品中阿魏酸、丹皮酚的含量比較穩定，說明該工藝穩定性好，檢測方法可行。

表10 含量測定結果

3 討 論

本試驗從提取、濃縮和成型3個方面對溫經膏的工藝進行了較為全面的研究。溫經膏組方藥味較多，成分復雜，單一浸膏得率并不能完全反映溫經膏的內在質量。溫經湯中吳茱萸辛散溫通，溫經散寒；當歸、川芎活血祛瘀，養血調經；牡丹皮既助活血散瘀，又清血分虛熱；諸藥配伍，共奏溫經散寒、養血祛瘀之效。上述中藥在“溫經膏”中針對主病主證起主要治療之作用，為本膏方之君藥部分。吳茱萸因有小毒，在整個處方中的藥占比偏低，從而使吳茱萸的主要有效成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量偏低，不易檢測；阿魏酸是2020年版《中華人民共和國藥典》一部中當歸和川芎質量控制的指標成分；丹皮酚是牡丹皮中主要的有效成分，且為牡丹皮質量控制的指標成分。因丹皮酚可隨水蒸氣蒸餾，阿魏酸不穩定，見光、加熱均易分解，在水提和濃縮過程中，提取次數、提取時間、濃縮方法和濃縮溫度都會對阿魏酸和丹皮酚的含量產生影響[19-21]，故選擇將阿魏酸和丹皮酚的含量測定作為溫經膏水提工藝和濃縮工藝的重要考察指標。

本研究將熵權法和G1法有效地結合起來，從主觀、客觀兩方面進行綜合評價，可同時兼顧決策者的主觀性和待評價對象各指標的內在聯系。這將使溫經膏提取工藝的多指標綜合評價結果更加科學合理。本研究通過單因素考察，確定了溫經膏水提的最佳浸泡時間。本研究采用基于G1-熵權法的主客觀組合賦權法的L9（34）正交設計，以加水量、提取時間和提取次數為考察因素，丹皮酚、阿魏酸提取量及干膏率為評價指標，優選出溫經膏的最佳水提工藝，最佳水提工藝為第1次加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2.0 h，第2次加8倍量的水，煎煮1.5 h。本研究從濃縮方式和濃縮溫度兩方面分別對濃縮工藝進行研究，結果表明，當溫度為70℃，真空度為-0.06～-0.08 Mpa時，濃縮過程對阿魏酸和丹皮酚的破壞最小。成型工藝方面主要是從煉糖與清膏的配比進行考察，當煉糖與清膏質量比為1.5∶1時，成品的口感較好，黏稠度適中，不溶物符合規定，相對密度既能滿足煎膏劑要求，其流動性又能滿足包裝設備要求。最后經3批試驗驗證，重復性良好。

本研究篩選出的溫經膏制備工藝穩定可行，建立的含量測定方法專屬性強、準確度高、重現性好，能夠作為溫經膏的質量控制標準。由于實驗條件限制，本研究未能建立溫經膏多組分一測多評的含量測定方法，這是本試驗的不足之處。課題組后續將對溫經膏進行高效液相指紋圖譜研究，在此基礎上采用HPLC多波長切換法實現溫經膏多種成分含量測定，旨在為溫經膏的關鍵質量屬性研究提供參考，為后續相關制劑的制備工藝、質量控制以及產品安全性、穩定性的評價提供借鑒。