活血消癭方含藥血清對脂多糖誘導的甲狀腺濾泡上皮細胞炎性損傷、凋亡及JAK2/STAT3通路的影響*

裴 迅，左新河，趙 勇，李 揚，付 暢

（湖北省中醫院/湖北中醫藥大學附屬醫院/湖北省中醫藥研究院，湖北 武漢 430074）

結節性甲狀腺腫以甲狀腺腫大伴結節為主要表現，多在彌漫性腫大的基礎上發生，為彌漫性腫大的晚期表現[1]。近年來其發病有明顯上升趨勢，雖然多為良性結節，但由于患者一方面擔心結節繼續增大而引起壓迫癥狀需要接受手術治療，另一方面擔心其惡變，給患者的生活帶來了困擾，嚴重影響患者的生活質量[2]。因此，控制結節的增大及阻止其向惡性轉化成為當前內科治療的關鍵。中醫學將結節性甲狀腺腫歸于“癭病”范疇，認為痰瘀、氣滯是其主要病理因素[3]。湖北省陳氏中醫癭病學術流派代表性傳承人陳如泉教授所擬中藥復方制劑活血消癭方，是活血化痰、消癭散結治法的代表方，用以治療結節性甲狀腺腫，臨床療效確切[4-5]，然而其具體的作用機制尚不完全清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也被稱為內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是誘導上皮細胞炎性損傷的炎性啟動子[6-7]。因此，本研究將構建LPS誘導的TFECs損傷模型，觀察活血消癭方含藥血清對TFECs損傷模型細胞形態及凋亡情況的影響，并探討其作用機制是否與Janus激酶2（Janus kinase2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路有關，旨在為結節性甲狀腺腫的中醫治療提供新的思路和實驗依據。

1 材 料

1.1 實驗動物6～8周SPF級SD雄性大鼠30只，體質量140～160 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠均在本院動物實驗中心實驗室集中分籠飼養，5只/籠，飼養環境為恒溫（20℃）、恒濕（50%）、12/12 h循環，自由飲食飲水，生長良好。本研究經本院動物倫理委員和醫學實驗動物管理委員會批準，遵循3R原則處理實驗動物。

1.2 藥物與試劑 活血消癭方由蜣螂蟲、土鱉蟲、蜈蚣、桃仁、莪術、貓爪草、王不留行、柴胡等組成，上述藥材均由本院藥劑科提供；LPS（批號：L5293）購自Sigma-Aldrich公司；優甲樂（左甲狀腺素鈉片）（批號：H20140052）購自德國默克公司；MTT試劑（批號：ST1537）購自上海碧云天公司；甲狀腺球蛋白（Tg）抗體（批號：ab156008）、JAK2抗體（批號：ab32101）、p-JAK2抗體（批號：ab32101）、STAT3抗體（批號：ab68153）、p-STAT3抗體（批號：ab267373）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抗體（Caspase-8）（批號：ab32397）、Caspase-3抗體（批號：ab32351）、B淋巴細胞瘤-2抗體（Bcl-2）（批號：ab32124）、Bax抗體（批號：ab32503）、p53抗體（批號：ab26）均購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號：GK10009）購自美國Glpbio公司；胰蛋白酶（批號：E020）購自上海如吉生物公司。1.3主要儀器SMZ745型光學顯微鏡（日本尼康公司）；DYCZ-24EN型蛋白電泳儀、170-3940型Trans-Blot SD半干轉印槽轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；GIS-500型凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 TFECs原代細胞分離與培養 將文獻[8]的方法改良后，無菌分離SD雄性大鼠雙側甲狀腺組織。將每側甲狀腺組織剪切成1.5 cm3的小塊，消化酶（含0.5 mL的206 kU/L膠原酶I和0.5 mL的2.75 kU/L消化酶）消化、離心后，棄上清，使用RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×105個/mL，經特異抗原NIS免疫熒光染色鑒定為TFECs后，接種至6孔細胞培養板上，每隔3 d換液1次。

2.2 制備活血消癭方含藥血清 取30只SD雄性大鼠，按照隨機數字表法分為對照組、優甲樂組和活血消癭方組，每組10只。優甲樂組和活血消癭方組大鼠每天分別灌服0.1 mg/L的優甲樂溶液2 mL和27 g/kg的活血消癭方，對照組大鼠每天灌服等體積的雙蒸水，連續7 d。大鼠于末次灌胃1 h后，摘除眼球取血，無菌分離得到對照血清、優甲樂含藥血清和活血消癭方含藥血清，經56℃、30 min滅活處理，再用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存備用。

2.3 MTT法檢測TFECs增殖情況TFECs接種至96孔板，24 h后，除去原來的培養液，分別添加0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%、80.0%活血消癭方含藥血清和對照血清，孵育12 h后，采用1 mg/L LPS[9]處理24 h，然后分別加入20 μL MTT試劑（5 mg/mL），繼續培養4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A）值，并計算其增殖抑制率（%）=（A對照組-A給藥組）/A對照組×100%。然后使用SPSS 22.0軟件通過增殖抑制率計算活血消癭方半數抑制濃度（IC50）。

2.4 細胞模型的建立與分組 在前期預實驗的基礎上，將體外培養的TFECs分為對照組、模型組、低濃度活血消癭方含藥血清組、中濃度活血消癭方含藥血清組、高濃度活血消癭方含藥血清組和優甲樂含藥血清組。對照組培養基中加入對照血清；模型組培養基中加入對照血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；低濃度活血消癭方含藥血清組培養基中加入50%IC50即10%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；中濃度活血消癭方含藥血清組培養基中加入100%IC50即20%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；高濃度活血消癭方含藥血清組培養基中加入含200%IC50即40%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；優甲樂含藥血清組培養基中加入優甲樂含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h。給藥結束后，收集各組細胞，對各指標進行檢測。

2.5 ELISA法檢測各組TFECs中炎癥因子水平 使用ELISA試劑盒檢測各組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6水平，具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.6 流式細胞儀檢測各組TFECs凋亡率 收集各組TFECs，采用流式細胞儀測定其凋亡情況，計算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2.7 Western blotting檢測各組TFECs中各蛋白表達水平 提取各組TFECs總蛋白后進行定量、電泳及轉膜，脫脂奶粉封閉 后 加 入Tg、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53抗體，4℃培養過夜，加入相應二抗，繼續培養2 h。ECL顯影后，以GAPDH為內參，分析各組TFECs中各蛋白表達情況。

2.8 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs增殖的影響與對照血清組比較，不同濃度活血消癭方含藥血清處理后細胞增殖抑制率均明顯升高（P<0.05），且增殖抑制率隨著濃度的增加而升高。活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs增殖抑制率的IC50為20%。（見表1）

表1 活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs增殖的影響（±s，n=6）

表1 活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs增殖的影響（±s，n=6）

注：與對照組比較，aP<0.05

組別 增殖抑制率（%）對照血清組 -0.5%活血消癭方含藥血清組 4.62±0.83a 1%活血消癭方含藥血清組 8.43±1.08a 2.5%活血消癭方含藥血清組 16.75±1.65a 5%活血消癭方含藥血清組 30.54±2.68a 10%活血消癭方含藥血清組 41.32±3.05a 20%活血消癭方含藥血清組 50.96±2.13a 40%活血消癭方含藥血清組 83.16±1.62a 80%活血消癭方含藥血清組 90.48±1.71a F 1925.000 P 0.000

3.2 活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs形態的影響對照組TFECs呈多邊形或瓷磚樣，細胞較小且排列緊密，膠質豐富，折射清晰；與對照組比較，模型組TFECs變大，排列松散，呈碎片狀，膠質減少，折射不清晰；與模型組比較，優甲樂含藥血清組和低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs排列逐漸緊密，且膠質增多。（見圖1）

圖1 各組TFECs形態比較（×200）

3.3 活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs細胞中Tg蛋白的影響 與對照組比較，模型組TFECs細胞中Tg蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs細胞中Tg蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），且具有濃度依賴性；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs細胞中Tg蛋白表達與優甲樂含藥血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組TFECs中Tg蛋白表達比較（±s，n=6）

表2 各組TFECs中Tg蛋白表達比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

組別 Tg對照組 0.73±0.02模型組 0.35±0.03a低濃度活血消癭方含藥血清組 0.49±0.02b中濃度活血消癭方含藥血清組 0.57±0.03b c高濃度活血消癭方含藥血清組 0.71±0.05b c d優甲樂含藥血清組 0.72±0.04b c d F 127.612 P 0.000

3.4 活血消癭方對LPS誘導的TFECs中炎癥因子的影響 與對照組比較，模型組TFECs中TNF-α、IL-6含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中TNF-α、IL-6含量均明顯降低（P＜0.05），且低濃度活血消癭方含藥血清組＞中濃度活血消癭方含藥血清組＞高濃度活血消癭方含藥血清組；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中TNF-α、IL-6含量與優甲樂含藥血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組TFECs中炎癥因子水平比較（±s，n=6）

表3 各組TFECs中炎癥因子水平比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

組別 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）對照組 31.25±8.36 19.16±6.47模型組 76.41±10.32a 52.57±7.23a低濃度活血消癭方含藥血清組 60.34±9.24b 40.75±6.53b中濃度活血消癭方含藥血清組 46.17±9.78b c 29.29±6.89b c高濃度活血消癭方含藥血清組 30.36±10.21b cd 18.34±7.32b cd優甲樂含藥血清組 29.46±8.15b cd 17.24±7.18b cd F 25.435 25.890 P 0.000 0.000

3.5 活血消癭方對LPS誘導的TFECs凋亡的影響 與對照組比較，模型組TFECs凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-8和Bax表達水平均明顯升高（P＜0.05），而Bcl-2和p53蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-8和Bax蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），而Bcl-2和p53蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs凋亡率及相關蛋白表達水平與優甲樂含藥血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖2～3、表4～5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

圖2 各組TFECs凋亡流式圖

3.6 活血消癭方對LPS誘導的TFECs中JAK2/STAT3信號通路蛋白的影響 與對照組比較，模型組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯上調（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯下調（P＜0.05）；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值與優甲樂含藥血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖4、表6）

表6 各組TFECs中JAK2/STAT3信號通路蛋白比較（±s，n=6）

表6 各組TFECs中JAK2/STAT3信號通路蛋白比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP<0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP<0.05

組別 p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3對照組 0.23±0.03 0.26±0.02模型組 0.65±0.05a 0.71±0.04a低濃度活血消癭方含藥血清組 0.52±0.04b 0.58±0.04b中濃度活血消癭方含藥血清組 0.37±0.03b c 0.41±0.05b c高濃度活血消癭方含藥血清組 0.22±0.04b cd 0.25±0.03b cd優甲樂含藥血清組 0.21±0.02b cd 0.24±0.03b cd F 153.600 178.527 P 0.000 0.000

圖4 各組TFECs中JAK2/STAT3信號通路蛋白表達免疫印跡圖

圖3 各組TFECs中凋亡相關蛋白表達免疫印跡圖

4 討論

由于結節性甲狀腺腫病情的反復進展，濾泡上皮由彌漫性增生轉變為局灶性增生，同時發生增生性病變和退行性病變的反復交替。腺體內出現不同發展階段的結節，出現毒性癥狀時，即為毒性結節性甲狀腺腫；若上皮細胞出現過度增生，可進一步形成腺瘤或乳頭狀腺癌，也可形成甲狀腺癌，且具有較高的癌變率[11]。國內報道結節性甲狀腺腫伴甲狀腺癌發生率逐年升高[12]。因此，明確結節性甲狀腺腫的轉化機制不僅能為早期診斷提供支持，還能進一步研究出阻止結節性甲狀腺腫發展的針對性干預措施，進而降低其癌變率或延緩其發展進程。

中醫學將結節性甲狀腺腫歸屬于“癭病”范疇，認為痰瘀貫穿于整個病程之中[12]。陳如泉根據痰血瘀阻理論創立了活血消癭方，該方在結節性甲狀腺腫的臨床治療中被廣泛使用[13]。吳淑瓊等[5]研究發現，活血消癭方能夠通過降低結節性甲狀腺腫患者血清中血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子水平并適度升高轉化生長因子-β1水平來發揮治療作用。此外，活血消癭片合夏枯草膠囊可有效治療橋本甲狀腺炎伴結節[14]。既往研究[15]發現活血消癭片能夠有效降低缺碘性甲狀腺腫模型大鼠的甲狀腺質量，但對甲狀腺功能的影響較小。目前，活血消癭方治療甲狀腺疾病的分子機制尚不明確。本研究表明，LPS誘導后TFECs細胞損傷加重，Tg表達降低，TNF-α、IL-6升高，且表現出明顯的細胞凋亡，以上結果均說明模型構建成功。Tg蛋白是TFECs細胞內膠質的主要成分，其含量可反映TFECs的損傷程度[16]。有研究[17]表明，優甲樂對結節性甲狀腺腫有治療作用。因此，本研究以優甲樂含藥血清為陽性對照，觀察活血消癭方含藥血清對LPS誘導的大鼠TFECs損傷模型細胞的影響。結果顯示，活血消癭方含藥血清可改善TFECs損傷，增加膠質含量，且能夠逆轉LPS誘導的炎癥因子和凋亡率的升高。說明活血消癭方含藥血清能通過降低凋亡蛋白和炎癥因子表達來改善LPS誘導的大鼠TFECs凋亡，并減輕其炎性損傷。

JAK2/STAT3信號通路與細胞損傷或細胞凋亡密切相關。JAK2是STAT3的上游激活劑，LPS的刺激可使JAK2活化，從而促進下游STAT3蛋白發生磷酸化，最后導致腸上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞損傷[18-19]。另外，JAK2、STAT3磷酸化程度的降低能夠抑制LPS誘發的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥的發生[20]。然而，目前尚無JAK2/STAT3信號通路在TFECs中的研究。本研究發現，LPS誘導的TFECs中JAK2、STAT3磷酸化水平顯著上調，與QIN Y等[21]在肺泡上皮細胞中的研究一致，而活血消癭方含藥血清能抑制其磷酸化。說明活血消癭方含藥血清對LPS誘導的TFECs凋亡和損傷的抑制作用可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路實現的。

綜上所述，活血消癭方含藥血清可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路，減輕LPS誘導的TFECs炎性損傷，并抑制細胞凋亡。本研究結果可為結節性甲狀腺腫的中醫治療提供新思路，但是本研究僅在細胞層面探討了活血消癭方的作用機制，后續仍需進行動物實驗，繼續深入研究。