補腎通絡方對去勢大鼠骨質疏松癥模型子宮內膜和骨量流失的影響*

凌家艷，劉 慶，馬 威，薛 莎

（1.武漢市第一醫院，湖北 武漢 430030；2.湖北省中醫院，湖北 武漢 430061）

骨質疏松癥是以骨密度及骨質量下降、骨微結構改變等為主要表現，導致骨脆性增加、骨折及全身性骨病發生的一類與年齡相關的代謝性疾病[1]。絕經后女性因卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導致骨量下降，易發絕經后骨質疏松癥。骨質疏松癥可導致駝背、骨痛，甚至骨質疏松性骨折。流行病學調查顯示年齡超過50歲的人群骨質疏松癥患病率為19.2%，年齡超過60歲的人群患病率超過30%[2]。研究預測，至2050年，我國骨質疏松性骨折人數將達599萬[3]，將會對個體及社會造成嚴重的經濟負擔。近年來，越來越多的研究表明Wnt通路是研究骨質疏松癥治療方法極為有效的通路之一[4]。補腎中藥可通過調節骨吸收與骨形成平衡，減少激素水平降低造成的骨高轉換，提高骨密度，減少骨量丟失[5-6]。補腎通絡方是我院名老中醫經驗方，能改善骨質疏松癥狀，提高骨密度。本研究主要通過觀察該方對去勢骨質疏松癥模型大鼠第四腰椎骨密度和骨微結構，血清雌激素、卵泡刺激素、黃體生成素水平，以及子宮內膜Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討該方治療絕經后骨質疏松癥的作用機制，為其臨床運用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4個月齡健康SPF級雌性SD大鼠40只，體質量270～300 g，購自湖北省實驗物研究中心，動物合格證編號：No.42000600017472，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養室溫度控制于22～26℃，空氣濕度40%～50%，自由進食飲水，12 h間隔照明，適應性喂養1周。實驗方案經武漢市第一醫院倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 補腎通絡方，方藥組成：淫羊藿15 g，杜仲10 g，川牛膝10 g，黃芪10 g，生地黃10 g，丹參10 g，雞血藤15 g。以上藥材均購于湖北天濟中藥飲片有限公司。補腎通絡方按照常規方法煎煮，濃縮至生藥質量濃度為1.44 g/mL，放置4℃冰箱保存備用。戊酸雌二醇片（注冊證號J20130009，規格：1 mg）購于法國Delpharm Lille SAS公司，制備成水溶液，質量濃度為0.009mg/mL。雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號：C0102210102）、卵泡刺激素（FSH）ELISA試劑盒（批號：C0109460150）、黃體生成素（LH）ELISA試劑盒（批號：C0108460149）均購自華美公司；β-catenin試劑盒（批號：GB11015）、ERα試劑盒（批號：GB13205）均購自賽維爾公司。

1.3 主要儀器PL-203型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）公司]；BR4i型臺式離心機（法國JOUAN公司）；Epoch型酶標儀（美國BioTek公司）；Donatello型脫水機（意大利DIAPATH公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；uCT50型Micro-CT（瑞士SCANCO公司）。

1.4 造模與分組 適應性喂養1周后，將40只大鼠按隨機數字表法分為假手術組（8只）和造模組（32只）。參照文獻[7]造模，造模組大鼠禁食不禁水12 h，經腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，腹部去毛，逐層切開，進入腹腔，切除雙側卵巢。假手術組大鼠切除卵巢周圍少量脂肪組織。術后肌內注射青霉素3 d。1周后連續5 d行陰道涂片檢查，無周期性變化表明去勢成功。全部造模成功后，將造模成功大鼠隨機分為模型組、戊酸雌二醇組、補腎通絡方高劑量組、補腎通絡方低劑量組，每組8只。

1.5 實驗給藥 各組藥物劑量按照人鼠體表面積法[8]進行折算。戊酸雌二醇組按0.09 mg/kg灌胃，補腎通絡方高、低劑量組分別按14.4、7.2 g/kg灌胃。各藥物組按1 mL/100 g體質量給予相應的藥物灌胃，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。1次/d，連續給藥3個月。

1.6 觀察指標

1.6.1 性激素 末次給藥后24 h，大鼠麻醉后心臟取血，3000 r/min離心10 min后分離得到血清。ELISA法檢測血清E2、FSH、LH水平。

1.6.2 micro-CT檢測 將各組大鼠完整的第四腰椎置于micro-CT系統上進行掃描，應用自帶軟件進行骨密度測定和骨組織形態學計量分析，包括骨體積分數（BV/TV）、骨表面積和骨體積的比例（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁數量（Tb.N）。

1.6.3 子宮內膜HE染色 將大鼠子宮投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，酒精中脫水，常規石蠟包埋，進行組織切片，厚度為5 μm。常規蘇木素-伊紅染色、中性樹膠封片后，光鏡下觀察子宮內膜形態學變化。

1.6.4 子宮內膜ERα、β-catenin免疫組化檢測 分離出大鼠子宮內膜，4%多聚甲醛溶液固定1 d，常規石蠟包埋、切片。室溫封閉30 min，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜；PBS洗滌后滴加稀釋好的二抗，37℃孵育30 min。PBS清洗后，DAB避光顯色，鏡下觀察直到棕黃色陽性結果出現。水洗、蘇木素復染、脫水、中性樹膠封片。以細胞膜或細胞漿著色為棕黃色定為陽性細胞。應用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件系統，每張切片選擇5個視野拍照，計算每組標本切片中平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.7 統計學方法 采用SPSS 27.0統計軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較 模型組大鼠血清E2含量低于假手術組（P＜0.05），FSH、LH水平高于假手術組（P<0.05），表明去勢成功。補腎通絡方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清E2含量均明顯高于模型組（P<0.05），FSH、LH水平均明顯低于模型組（P<0.05）；補腎通絡方高、低劑量組大鼠血清E2、FSH、LH水平與戊酸雌二醇組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(只)給藥劑量 E2（pg/mL) FSH（IU/L） LH（IU/L）假手術組 8 - 124.084±11.72118.550±7.8410.823±0.286模型組 8 - 98.086±7.283a 34.181±6.876a 1.666±0.602a補腎通絡方高劑量組8 14.40 g/kg 114.241±18.314b 20.658±7.437b 0.949±0.410b補腎通絡方低劑量組8 7.20 g/kg 112.569±13.982b 22.460±12.827b 0.983±0.369b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 118.538±11.489b 19.030±7.620b 0.818±0.269b F 4.411 4.303 6.092 P 0.000 0.006 0.000

2.2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結構比較 與假手術組比較，模型組大鼠骨密度、骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）均明顯降低（P＜0.05），骨表面積和骨體積的比例（BS/BV）、骨小梁分離度（Tb.Sp）均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，補腎通絡方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨密度、BV/TV均明顯升高（P＜0.05），Tb.Sp均明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補腎通絡方高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠Tb.N和Tb.Th均明顯升高（P<0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結構比較（±s）

表2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結構比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 BV/TV BS/BV(1/mm) Tb.N(1/mm) Tb.Th(mm) Tb.Sp(mm) BMD(mg/cm3)假手術組 8 - 0.512±0.122 15.820±2.717 4.649±0.319 0.151±0.030 0.111±0.025 0.641±0.028模型組 8 - 0.339±0.036a 20.399±2.299a 3.599±0.529a 0.094±0.009a 0.157±0.02a 0.589±0.023a補腎通絡方高劑量組 8 14.40 g/kg 0.493±0.122b 16.618±3.329 4.224±0.289b 0.142±0.029b 0.117±0.032b 0.629±0.007b補腎通絡方低劑量組 8 7.20 g/kg 0.459±0.097b 18.024±3.989 4.092±0.273 0.115±0.022 0.123±0.024b 0.626±0.026b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 0.510±0.158b 16.510±3.761 4.303±0.413b 0.141±0.035b 0.116±0.035b 0.635±0.005b F 1.983 1.539 5.107 3.915 3.964 4.865 P 0.136 0.229 0.005 0.017 0.016 0.007

2.3 各組大鼠子宮內膜形態學變化 假手術組大鼠子宮內膜細胞排列整齊，腺體上皮呈高柱狀，腺腔較大；模型組大鼠子宮內膜變薄，腺體稀少，部分呈囊性；戊酸雌二醇組大鼠子宮內膜增厚，少數腺體扭曲，腺上皮核大呈卵圓形，間質細胞較致密；補腎通絡方高、低劑量組大鼠子宮內膜間質細胞梭形，較致密，腺上皮細胞呈低柱狀，且隨劑量增加，腺體數量明顯增加。（見圖1）

圖1 各組大鼠子宮內膜形態學變化比較（HE，×100）

圖3 各組大鼠子宮內膜β-catenin表達（免疫組化，×400）

2.4 各組大鼠子宮內膜ERα和β-catenin蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠子宮內膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎通絡方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠子宮內膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達水平均明顯升高（P＜0.05）；補腎通絡方高、低劑量組大鼠子宮內膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達水平與戊酸雌二醇組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表3、圖2～3）

表3 各組大鼠子宮內膜ERα和β-catenin蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠子宮內膜ERα和β-catenin蛋白表達水平比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(只)給藥劑量 ERα β-catenin假手術組 8 - 0.092±0.015 0.089±0.01模型組 8 - 0.062±0.015a 0.062±0.012a補腎通絡方高劑量組 8 14.40 g/kg 0.084±0.011b 0.084±0.011b補腎通絡方低劑量組 8 7.20 g/kg 0.081±0.014b 0.079±0.017b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 0.091±0.014b 0.086±0.015b F 6.042 5.166 P 0.000 0.002

圖2 各組大鼠子宮內膜ERα表達（免疫組化，×400）

3 討論

絕經后骨質疏松癥屬于中醫學中“骨痹”“骨痿”“骨枯”等范疇[9-10]?！端貑枴ゐ粽撈吩唬骸澳I主身之骨髓。”《素問·逆調論篇》曰：“腎者水也，而生于骨。腎不生則髓不能滿，故寒甚至骨也?！蹦I精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養而強勁有力；腎精虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養而痿弱無力。婦女絕經后，腎氣漸衰，天癸漸竭，骨髓化生無源，致髓枯骨脆、筋骨不堅；五臟虛損，氣虛血瘀，新血生成受阻，骨髓化源不足，骨骼失養，骨質流失[11-12]。腎虛為本，血瘀為標，臨床治療在補腎益精同時兼顧益氣活血。補腎通絡方是我科治療絕經后骨質疏松癥的經驗方，臨床效果明顯。方中淫羊藿、杜仲補腎助陽，共為君藥；川牛膝活血化瘀、通利關節，雞血藤、丹參活血通絡，共為臣藥；生地黃養陰生精，黃芪補氣，共為佐藥。諸藥合用，共奏補腎通絡、活血壯骨之功。

Micro-CT能夠直觀、立體地從空間結構上評價骨小梁微結構，指導臨床用藥和預防骨質疏松性骨折的發生。本實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠骨密度明顯降低（P＜0.05），說明骨質疏松癥模型制備成功。補腎通絡方高、低劑量組大鼠骨密度明顯高于模型組（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠骨體積分數、骨小梁數量、骨小梁厚度均降低，骨小梁分離度升高，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，補腎通絡方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨體積分數明顯升高（P＜0.05），骨小梁分離度明顯降低（P＜0.05）；補腎通絡方高劑量組和戊酸雌二醇組骨小梁數量和骨小梁厚度均明顯高于模型組（P＜0.05），骨微結構明顯改善。

絕經后由于卵巢功能減退，E2含量明顯降低，在生殖軸負反饋調節下，腺垂體分泌的FSH和LH濃度升高[13]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清E2含量降低、FSH和LH水平升高（P＜0.05），表明去勢成功。補腎通絡方高、低劑量組能升高去卵巢大鼠的血清E2含量，降低FSH和LH水平，與戊酸雌二醇組相比無明顯差異。同時，HE染色顯示，模型組大鼠子宮內膜變薄，腺體稀少。藥物干預后，子宮內膜增厚，腺體稍增加，補腎通絡方高、低劑量組和戊酸雌二醇組差異不明顯。說明補腎通絡方具有雌激素樣作用。

雌激素的生物學效應是通過和雌激素受體（ER）結合來發揮的，其作用與ER的類型和數量有關[14]。雌激素受體有ERα和ERβ兩種，其中ERα主要分布在子宮和乳腺[15]。ABBOTT M J等[16]研究發現ERα在女性絕經前、后子宮黏膜層、肌層、漿膜層所有細胞的細胞漿中均有表達，絕經后水平較絕經前降低。ERα和Wnt/β-catenin信號通路在大鼠BMSCs成骨分化過程中具有重要意義[17-18]。Wnt信號刺激后，β-catenin積聚并轉入細胞核內，與轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子相結合，啟動轉錄相關基因，使細胞活化增強，加強骨形成[19-20]。本研究免疫組化結果顯示去勢大鼠子宮內膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin蛋白表達降低，經補腎通絡方干預后，ERα和β-catenin表達均增強，與假手術組無明顯差異。

綜上所述，補腎通絡方能改善去勢骨質疏松癥模型大鼠的骨量流失，具有雌激素樣作用，可能是通過上調去勢骨質疏松癥模型大鼠子宮內膜ERα表達，激活Wnt/β-catenin信號通路而介導的。下一步研究還需要擴大樣本量和體外實驗來證實藥物的有效性與安全性。