腦脈利顆粒對斑馬魚糖尿病性視網膜病變的治療作用研究

蘇 梅，婁雅靜，王 姍，李雙利，秦引林

（1.江蘇柯菲平醫藥股份有限公司，江蘇 南京 210016；2.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 210009）

糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者中首要的并發癥，也是最為嚴重的并發癥之一，是一種由視網膜缺血、炎癥、新生血管異常導致的眼底病變[1]。據統計，目前全球大約有超過2.8億人存在視力損害和失明，如白內障、青光眼、老年性黃斑變性和糖尿病性視網膜病變等，研究認為長期高血糖是該類疾病的主要病因之一[2]。

根據疾病進展DR可分為早期的非增生性糖尿病性視網膜病變（NPDR）和晚期的增生性糖尿病視網膜病變（PDR）兩個階段。當NPDR發展為PDR階段，本病可以引起視力下降甚至失明[3]。在NPDR期，結締組織生長因子（CTGF）和一氧化氮（NO）水平均升高。CTGF濃度與玻璃體視網膜纖維化之間的正相關程度證實了CTGF參與并促進了纖維血管膜的形成[4]；CTGF水平降低，對功能性血管網絡的建立無影響[5]。即使疾病進一步發展為PDR，靶向的CTGF治療也可以降低臨床給予抗VEGF藥后導致的CTGF水平升高，降低纖維化和牽引性視網膜脫離的風險[6]。在視網膜中NO通過參與光轉導過程起維持正常視覺功能的作用，在正常情況下NO可參與視網膜血流控制和介導乙酰膽堿、緩激肽等物質引起的血管擴張反應。在DR中，NO通過抑制視網膜色素上皮（RPE）細胞的增殖，減少視桿細胞外節的吞噬作用，進一步影響視網膜中的神經元和感光細胞[7]。控制NO水平可有效預防DR的嚴重程度增加[8-9]。此外，隨著病情加重，DR患者玻璃體或房水中的炎癥因子水平上升。這些炎性介質的積累會造成視網膜早期神經元細胞的死亡[10]。

近年來，中醫藥治療已經成為研究熱點，但臨床治療DR的中成藥卻不多。腦脈利顆粒由益母草、三七、黃芪、姜黃、川芎、紅花、丹參、赤芍、當歸、白芍、川牛膝等制成，具有抗炎、促進血管新生作用[11]。基于此，本研究采用高濃度葡萄糖作為誘導因子，模擬視網膜病變的產生與病變過程對斑馬魚的形態、視網膜微血管病變、炎癥的影響，并對NO和CTGF水平進行檢測，以探究腦脈利顆粒是否能夠治療糖尿病性視網膜病變，旨在為臨床上治療DR提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 受精后3 dpf[12]野生型AB品系斑馬魚來自國家斑馬魚資源中心，南京睿鷹潤澤生物醫藥科技有限公司構建轉基因型血管內皮細胞增強型綠色熒光蛋白標記（flil：EGFP）品系斑馬魚和轉基因型中性粒細胞增強型綠色熒光蛋白標記（mpx：EGFP）品系斑馬魚，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0019。斑馬魚飼養于28℃的養魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm；pH值為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。

按照《The Zebrafish Book》中方法飼養斑馬魚，保持循環系統水溫為28.5℃，每天固定光照時間為14 h，早晚飼喂豐年蝦（天津豐年水產養殖有限公司生產）各一次。收集胚胎前一天晚上將斑馬魚雌魚、雄魚放置于產卵缸中，以隔板將雌雄隔開，按照正常飼養光照時間，22:30:00關燈，次日08:30:00光照刺激并抽離隔板使雌雄接觸。30 min后收集胚胎并用egg water清洗后，飼養于28.5℃的光照培養箱中。本實驗經中國藥科大學動物倫理委員會批準（2020-11-015），符合3R原則。

1.2 藥物與試劑 腦脈利顆粒（批號：11-191010）購自南京柯菲平盛輝制藥有限公司，母液用超純水配制成250 mg/mL，再用egg water配制成工作液。復方血栓通膠囊（批號：181109）購自廣東眾生藥業股份有限公司，母液用超純水配制成9.6mg/mL，再用egg water配制成工作液。甲基纖維素（批號：20180110）、三卡因（批號：WXBD1416V）均購自南京化學試劑一廠；葡萄糖測定試劑盒（批號：WXEVE8YAXX）、NO測定試劑盒（批號：NHXGET5A9Q）均購自Elabscience；Trizol（批號：L/N7E403L0）購自南京諾唯贊生物試劑有限公司；SYBR Green real time PCR試劑盒（批號：A5502-1）購自Takara。

1.3 主要儀器Pax-250B型智能光照培養箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）；SZX16型斑馬魚體視鏡（Olympus）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；BSA224S型電子天平（美國Sartourius公司）；Research plus型移液器（德國Eppendorf公司）；SCIENT2-IID型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SYNERGY/HT型多功能酶標儀（Biotek）；StepOnePlus型實時熒光定量儀（Applied Biosystems）。

1.4 造模與分組 野生型AB品系斑馬魚胚胎（3 dpf）、轉基因型血管內皮細胞增強型綠色熒光蛋白標記（flil：EGFP）品系斑馬魚胚胎（3 dpf）、轉基因型中性粒細胞增強型綠色熒光蛋白標記（mpx：EGFP）品系斑馬魚胚胎（3 dpf），放置在6孔板中（每孔30個胚胎），每孔5 mL工作液，工作液中含有130 mmol/L的葡萄糖，維持培養3 d[12]，以斑馬魚體內血糖濃度升高、視網膜血管直徑增加、體內NO和CTGF水平升高、炎癥水平升高為判斷模型成功的標準[12]。不做任何處理、正常飼喂的斑馬魚作為對照組，高糖處理造模的斑馬魚隨機分為模型組、復方血栓通膠囊低劑量組、復方血栓通膠囊高劑量組、腦脈利顆粒低劑量組、腦脈利顆粒中劑量組、腦脈利顆粒高劑量組。

1.5 實驗給藥 將復方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚分別暴露于低、高濃度復方血栓通膠囊溶液（7.6、76 μg/mL）中，腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚分別暴露于低、中、高濃度腦脈利顆粒溶液（50、100、250 μg/mL）中，3 dpf時開始進行給藥處理，6 dpf時結束給藥。對照組及模型組斑馬魚不進行給藥處理。

1.6 觀察指標

1.6.1 斑馬魚存活率檢測 將轉基因型（flil：EGFP）斑馬魚胚胎（3 dpf）放置在6孔板中（每孔30個胚胎），每孔5 mL工作液，模型組及各給藥組工作液中含有130 mmol/L的葡萄糖和相應濃度的藥物。維持培養3 d后，6 dpf時統計致畸率及存活率。實驗進程見圖1。

圖1 實驗流程圖

1.6.2 葡萄糖水平的檢測 用葡萄糖測定試劑盒對斑馬魚的全身裂解物進行葡萄糖水平的定量分析。每個實驗組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中在冰上進行超聲處理。用葡萄糖標準溶液生成標準曲線。加入總量為2 mL的測定試劑，37℃孵育30 min。用配備gen5軟件的BioTek讀板儀測量540 nm處的熒光，檢測各個實驗組斑馬魚體內的葡萄糖水平。

1.6.3 斑馬魚眼睛大小的觀察 斑馬魚胚胎生長至6 dpf后，用三卡因溶液麻醉并固定后，用體視顯微鏡拍照，用Image J軟件測量斑馬魚眼睛和身體長度。體長為從頭部頂端到軀干末端（不包括尾鰭），眼睛長度為眼睛長軸前部至后部。同時，測量斑馬魚眼睛和身體面積，計算眼睛長度和身體長度的比值，以及眼睛面積和身體面積的比值。

1.6.4 玻璃體-視網膜血管直徑的測量6 dpf時，4% PFA固定斑馬魚幼魚，4℃過夜。用蒸餾水（1.5 mL/孔）洗滌3次，20 min/次，然后用含3%胰蛋白酶的Tris-HCl緩沖液（pH值為7.8）37℃孵育80 min后，分離出含有玻璃樣視網膜血管的晶狀體。使用Olympus體視顯微鏡。

1.6.5 中性粒細胞數量檢測 用轉基因型（mpx：EGFP）斑馬魚構建高葡萄糖誘導的視網膜損傷模型。在3 dpf時進行給藥處理；在6 dpf時，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚血管中綠色顆粒狀的中性粒細胞數量來反應炎癥程度。

1.6.6 qPCR法檢測斑馬魚CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平 在6 dpf時，從每個實驗組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中于冰上進行超聲處理，使用Trizol試劑提取樣品的總RNA，用PrimeScriptRTMaster Mix將RNA逆轉錄成cDNA，將cDNA作為模板應用于Thermal Cycler DiceRReal Time System進行定量PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6.7 斑馬魚全身裂解物NO水平 用NO測定試劑盒對斑馬魚的全身裂解物進行NO水平的定量分析。每個實驗組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中于冰上進行超聲處理。NO在體內或水溶液中極易氧化生成NO2-，與顯色劑生成淡紅色偶氮化合物，生成偶氮化合物的濃度與NO的濃度具有線性關系，通過比色可以計算NO的濃度。

1.7 統計學方法 用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統計學分析，origin8.0處理圖片，計量資料采用（±s）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩組間比較（多重比較）采用Dunnett's multiple comparisons test，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高葡萄糖對斑馬魚正常發育的影響

2.1.1 各組斑馬魚存活率比較 對照組斑馬魚未見死亡。與對照組比較，模型組斑馬魚胚胎的存活率明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，復方血栓通膠囊低劑量組斑馬魚胚胎的存活率明顯升高（P<0.01）；復方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚胚胎的存活率與模型相比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚胚胎的存活率均明顯升高（P<0.01），且隨著腦脈利顆粒劑量的增加，斑馬魚胚胎的存活率逐漸降低（P<0.05）。（見表2）

表2 各組斑馬魚存活率比較（±s）

表2 各組斑馬魚存活率比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與復方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.05；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.05

組別 胚胎數（個） 給藥劑量（μg/mL） 存活率（%）對照組 30 - 100.00±2.00模型組 30 - 83.33±3.72a復方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 100.00±1.77b復方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 80.00±5.00c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 100.00±1.00b d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 96.00±1.00b c d e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 93.00±3.00b c d e f F 257.000 P 0.000

2.1.2 各組斑馬魚形態比較7組斑馬魚胚胎形態大小正常，未見胚胎畸形。（見圖2）

圖2 各組斑馬魚形態比較（×4）

2.2 腦脈利顆粒對高糖誘導的斑馬魚血糖的影響 與對照組比較，模型組斑馬魚體內血糖明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，復方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內血糖均明顯降低（P＜0.05），且均具有劑量依賴性；復方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚體內血糖均低于腦脈利顆粒低、中、高劑量組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組斑馬魚體內血糖比較（±s）

表3 各組斑馬魚體內血糖比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與復方血栓通膠囊低劑量組比較，cP＜0.05；與復方血栓通膠囊高劑量組比較，dP＜0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP＜0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP＜0.01

組別 胚胎數（個） 給藥劑量（μg/mL） 血糖（mmol/L）對照組 30 - 28.41±4.99模型組 30 - 454.55±10.01a復方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 217.67±11.04b復方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 170.45±14.96bc腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 426.14±12.92bcd腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 303.03±12.69bcde腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 274.62±15.67bcdef F 4375.000 P 0.000

2.3 腦脈利顆粒對高糖誘導的斑馬魚眼睛發育的影響7組斑馬魚眼睛長度/身體長度比值和眼睛面積/身體面積比值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組斑馬魚眼睛長度/身體長度的比值比較（±s，n=30）

圖4 各組斑馬魚眼睛面積/身體面積的比值比較（±s，n=30）

2.4 腦脈利顆粒對高糖誘導的斑馬魚玻璃體-視網膜血管直徑的影響 與對照組比較，模型組斑馬魚視網膜血管直徑明顯增大（P＜0.01）；與模型組比較，復方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚視網膜血管直徑均明顯減小（P＜0.05），且均具有劑量依賴性；復方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚視網膜血管直徑均明顯小于腦脈利顆粒低、中、高劑量組（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 各組斑馬魚玻璃樣視網膜血管圖（×200，標尺：25 μm）

圖6 各組斑馬魚視網膜血管直徑比較（±s，n=30）

2.5 腦脈利顆粒對高糖誘導的斑馬魚體內炎癥的影響

2.5.1 各組斑馬魚血管中中性粒細胞數量比較 對照組斑馬魚體內中性粒細胞數量正常；與對照組比較，模型組斑馬魚血管中中性粒細胞數量明顯增多；與模型組比較，復方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚血管中中性粒細胞數量均明顯減少。（見圖7）

圖7 各組斑馬魚血管中中性粒細胞數量比較（×8）

2.5.2 各組斑馬魚體內CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較 與對照組比較，模型組斑馬魚體內IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，復方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均明顯降低（P<0.05），且均具有劑量依賴性；腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內IL-1β mRNA水平均高于復方血栓通膠囊高劑量組（P<0.05）；復方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚體內IL-6 mRNA水平與腦脈利顆粒高劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；復方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚體內TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均高于腦脈利顆粒高劑量組（P<0.05）。（見表4）

表4 各組斑馬魚體內CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較（±s）

表4 各組斑馬魚體內CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與復方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.01

組別 胚胎數（個）給藥劑量（μg/mL）IL-1β mRNA IL-6 mRNA TNF-α mRNA CTGF mRNA對照組 30 - 1.01±0.48 1.01±0.02 1.00±0.03 1.01±0.001模型組 30 - 10.88±0.27a 8.45±0.50a 9.88±0.17a 2.78±0.04a復方血栓通膠囊低劑量組 30 7.6 7.86±0.33b 4.89±0.33b 7.31±0.22b 2.29±0.03b復方血栓通膠囊高劑量組 30 76.0 3.68±0.41b c 3.87±0.60b c 5.13±0.17b c 1.63±0.02b c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 10.36±0.47b c d 6.94±0.64b c d 8.67±0.24b c d 2.42±0.03b c d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 6.77±0.45b c d e 5.39±0.49b c d e 5.67±0.32b c d e 2.33±0.05b c d e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 4.62±0.34b c d e f 4.01±0.33b c d e f 2.71±0.28b c d e f 1.28±0.10b c d e f F 2408.000 808.500 6062.000 5425.000 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.6 各組斑馬魚體內NO水平比較 與對照組比較，模型組斑馬魚體內NO水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，復方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內NO水平均明顯降低（P<0.05），且具有劑量依賴性；復方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚體內NO水平與腦脈利顆粒高劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表5）

表5 各組斑馬魚體內NO水平比較（±s）

表5 各組斑馬魚體內NO水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與復方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.01

組別 胚胎數（個）給藥劑量（μg/mL）NO（pmol/mg）對照組 30 - 30.24±3.15模型組 30 - 70.25±4.27a復方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 45.30±4.30b復方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 39.61±6.44b c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 56.73±3.87b c d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 42.50±5.26b e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 38.27±4.58b c e f F 246.200 P 0.000

3 討論

斑馬魚作為常用的模式生物，與哺乳動物的遺傳和生理極為相似，且產卵量大，養殖簡單，發育時間短，72 hpf就具備視覺功能，能夠有效提高實驗效率[12]。本實驗采用高葡萄糖造模。與對照組比較，模型組斑馬魚血糖明顯升高、視網膜血管直徑明顯增大，且出現了多項DR關鍵指標如中性粒細胞、CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、NO的異常，表明造模成功。

DR的發病機制復雜，但疾病進展離不開視網膜中的炎癥與氧化應激反應[13]。中醫學認為DR屬本虛標實之證，氣陰血虛以致血行不暢、脈絡阻滯[14]。NO和CTGF水平對糖尿病視網膜病變的進展也有極大的影響。NO水平升高，不僅會影響視網膜中的神經元和感光細胞，還參與氧化/硝化應激反應，增加糖尿病性視網膜病變的嚴重程度[7]。臨床研究表明，糖尿病視網膜病變的嚴重程度與血清中NO水平呈正相關[15]。CTGF不僅參與促進纖維血管膜的形成，還可以分泌多種細胞外基質，誘導視網膜毛細血管基底層增厚[4]，增加糖尿病引起的周細胞丟失[16]。

目前針對DR的治療手段有限，主要有抗血管內皮生長因子藥物治療、抗炎治療、手術治療、激光光凝治療等手段，但這些治療手段存在一些弊端，比如抗VEGF藥物作為治療增殖性糖尿病性視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的一線藥物，因半衰期短，需要頻繁注射，患者依從性差，且頻繁注射使眼內炎的發病率增加[17]；單純應用全視網膜光凝治療嚴重非增殖性和增殖性糖尿病性視網膜病變有一定的療效，但效果不明顯[18]，而一些中成藥在防治DR上發揮了積極作用[19]。由多味傳統中藥通過現代化技術制成的腦脈利顆粒，具有益氣通脈、活血化瘀的功效，且具有毒副作用小、患者用藥依從性高的特點。本研究結果表明，腦脈利顆粒能夠有效降低糖尿病性視網膜病變斑馬魚模型體內的血糖濃度，減小視網膜微血管直徑，減輕炎癥反應，降低IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達水平，降低體內CTGF和NO水平，提示腦脈利顆粒對DR具有一定的改善作用。陽性對照藥物復方血栓通膠囊主要由三七、黃芪、玄參、丹參組成，在單獨使用或者聯合其他治療手段治療糖尿性病視網膜病變方面具有良好的效果[20-21]。據報道，三七的有效成分三七皂苷R1不僅具有良好的抗氧化應激作用，還具有明顯的抗DR療效[22]。腦脈利顆粒中含有三七、黃芪、丹參、益母草、姜黃、當歸、川牛膝等中藥，具有良好的補氣活血的功效，且腦脈利顆粒具有抗炎、抗氧化應激作用[23-24]。本研究表明，在降低斑馬魚 體內CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和NO水平方面，腦脈利顆粒與復方血栓通膠囊療效基本相當，但腦脈利顆粒還可以有效控制血糖濃度升高，延緩DR疾病發展，說明腦脈利顆粒治療該類疾病具有一定可行性。

本研究通過高濃度葡萄糖誘導斑馬魚視網膜病變模型驗證了腦脈利顆粒能夠降低血糖濃度，并改善其引起的視網膜病變。此外，腦脈利顆粒還可能通過調控炎癥因子、NO和CTGF水平來抑制DR的進展，提示腦脈利顆粒對高葡萄糖誘導的視網膜病變具有一定防治作用。本研究結果為該藥用于糖尿病性視網膜病變的治療提供了實驗依據，同時增加了對DR疾病發展的預防性藥物以及PDR期輔助治療藥物的選擇，拓展了糖尿病性視網膜病變治療藥物的研究方向。