基于分子對接及實驗驗證探討骨碎補總黃酮與脂肪因子結合防治絕經后骨質疏松癥的作 用 機 制*

吳睿哲，吳 潔，劉 凱，葛殊瑋，伍 強，王 凡，曾景奇

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.寧鄉市中醫院，湖南 寧鄉410601）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種女性絕經后性激素分泌缺乏導致成骨-破骨平衡被打破，出現骨吸收大于骨形成最終導致以骨量減少、骨密度（bone mineral density，BMD）降低、骨組織微環境及微結構改變為特征的常見原發性疾病。隨著雌激素分泌的驟然變化，部分女性絕經后出現脂代謝功能的紊亂，極易出現體質量指數（body mass index，BMI）的變化。有研究證明，BMI與BMD存在正相關性[1]，并被證實具有抑制骨質疏松（osteoporosis，OP）進展的作用，且有研究者認為機械性的應力刺激可增強骨重塑過程從而對抗BMI的增加[2]。隨著細胞分子層面上研究的深入，脂肪組織不再被認為是一種單純的儲能與供能組織；脂肪組織具有旁分泌、自分泌、免疫活性等功能，脂肪因子（adipokine）作為脂肪細胞分泌的多種信號分子已被證實能通過成骨-成脂平衡影響骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的分化。瘦素（leptin，LEP）、脂聯素（adiponectin，ADP）是脂肪因子家族的重要成員，兩者及其相應受體參與了調控成骨細胞的成骨-破骨平衡[3]。

近年來，對補腎類中藥防治骨質疏松癥機制作用研究取得了一定的成果[4]，其中補腎類代表藥物骨碎補在防治OP、骨組織重建修復等方面的作用逐漸引起眾多學者的關注。骨碎補有效成分骨碎補總黃酮的成分復雜，與脂肪因子作用防治PMOP的研究較少，故本研究通過分子對接對骨碎補總黃酮含有的多個主要活性成分與ADP、LEP的結合可能性進行預估，并通過動物實驗探討骨碎補總黃酮對絕經后骨質疏松癥大鼠血清ADP、血清LEP及BMD的影響，旨在為骨碎補防治PMOP的具體作用機制研究提供思路，并為臨床推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 分子對接

1.1.1 骨碎補總黃酮有效成分篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）中以“骨碎補”作為關鍵詞，進行藥物有效化學成分的篩選。根據ADME原則選取滿足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的化學成分，并通過分子結構篩選出有效成分中的黃酮類成分。

1.1.2 活性成分與核心靶點的分子對接 選取骨碎補總黃酮中關鍵成分與LEP、ADP進行分子對接。在RCSB PDB數據庫（https://www1.rcsb.org/）中下載LEP（PDB-ID：1AX8）及ADP（PDB-ID：6U66）的pdb格式結構文件；根據篩選結果在ZINC小分子數據庫（https://zinc.docking.org/）中下載骨碎補總黃酮關鍵成分的mol2格式結構文件。運用AutoDockTools1.5.6對骨碎補總黃酮關鍵成分與LEP、ADP進行分子對接，并用Pymol2.4.0對分子對接結果進行可視化呈現。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物6個月齡SPF級雌性、健康、成年、未孕SD大鼠40只，體質量（400±20）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心統一購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。在湖南中醫藥大學SPF級實驗室中進行實驗操作，飼養環境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食。取材時將大鼠麻醉處死。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核批準，批準編號：LL2020092504，實驗過程中參照國家《關于善待實驗動物的指導性意見》對大鼠進行處置，并按照4R原則給予人道關懷。

1.2.2 藥物與試劑 阿侖膦酸鈉片（商品名：福善美，規格：7 mg/粒，批號：20190611）購自杭州默沙東制藥有限公司；骨碎補總黃酮[商品名：強骨膠囊，規格：0.25 g/粒，其中有效成分（骨碎補總黃酮）約為0.18 g，批號：191011]購自北京岐黃制藥有限公司；LEP ELISA試劑盒（批號：E16036967）、ADP ELISA試劑盒（批號：D17036968）均購自武漢華美生物工程有限公司；雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號：501890）購自美國Cayman公司。

1.2.3 主要儀器H1650R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；PW-812型全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司）；MB-530型多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司）；DHP-500型電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）；HNCDC/CZG-10-103型骨密度儀（美國Hologic Discovery）。

1.2.4 分組與造模 將大鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只。造模參考文獻[5]，采用背側入路行雙側卵巢摘除手術以建立絕經后骨質疏松癥模型，10%水合氯醛（3 mL/kg）行腹腔麻醉，麻醉滿意后俯臥位固定大鼠，背側骶尾部至肋骨下緣備皮消毒，取背側肋緣下正中1.5 cm為中點做一長約1.5 cm縱行切口至皮下，牽拉切口左移1 cm垂直鈍性分離皮下肌肉組織顯露腹腔，可見大量白色脂肪組織，小心提拉探查脂肪組織，可見淡紅色桑葚狀卵巢組織及相連的輸卵管，3-0外科縫線環狀結扎卵巢與輸卵管連接處后，使用組織剪剪除卵巢，將剩余組織回納至腹腔并縫合肌肉組織，牽拉切口至中點右側1 cm，同前切除右側卵巢組織，逐層縫合術口，絡合碘二次消毒。空白組大鼠找到卵巢后，將卵巢從腹腔提出而不切除，僅切除周圍少量脂肪組織，術前0.5 h和術后3 d給予青霉素G鈉鹽5萬單位肌內注射，預防感染。

1.2.5 實驗給藥 造模2個月后，造模組大鼠骨密度明顯低于對照組則提示骨質疏松癥模型制備成功[5]，開始對各組大鼠灌胃給藥，給藥體積均為10 mL/kg。中藥組（骨碎補總黃酮）與西藥組（阿侖膦酸鈉）通過人與動物體表面積比值換算出等效用藥劑量，所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度。中藥組按照25 mg/kg劑量灌胃給藥，1次/d；西藥組按照4 mg/kg劑量灌胃給藥，1次/周；對照組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水。連續灌胃12周。

1.2.6 觀察指標

1.2.6.1 標本采集 給藥12周后，最后一次灌胃2 h后腹腔麻醉，腹主動脈采血4 mL，3000 r/min離心15 min，分離血清后分裝至-80℃冰箱中保存；脫頸椎處死各組大鼠，完整分離出左側股骨，小心剔除肌肉組織后，放入-80℃冰箱中保存，備用。

1.2.6.2 BMD檢測 取出備用的股骨，仔細剔除附著的肌肉軟組織，生理鹽水沖洗，雙能X線骨密度儀測定各組大鼠離體左側股骨骨密度。

1.2.6.3 E2、LEP、ADP含量檢測ELISA法分別檢測各組大鼠血清中的E2、LEP、ADP含量，嚴格按試劑盒說明書要求進行操作。1.3統計學方法 使用SPSS 23.0對實驗數據進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，使用GraphPad Prism 7.0進行數據可視化呈現。

2 結果

2.1 骨碎補總黃酮有效成分篩選 使用“骨碎補”作為關鍵詞在TCMSP數據庫進行檢索，獲得71種主要成分信息，使用ADME原則進行二次篩選后滿足OB值≥30%，DL值≥0.18的有效成分有18種，其中骨碎補黃酮類有效成分共10種。（見表1）

表1 骨碎補總黃酮有效成分信息表

2.2 分子對接結果及呈現 為進一步評價骨碎補總黃酮有效成分與ADP、LEP的親和能力，使用AutodockTools對篩選出的有效成分及目標靶點進行分子對接計算，對接結果見表2。根據DENNIS等[6]研究報道，結合能≤-4.0 kcal/mol表明分子與靶點具有一定的結合活性，結合能≤-5.0 kcal/mol表明分子與靶點具有良好的結合活性，結合能≤-7.0 kcal/mol表明分子與靶點具有明顯結合活性，故選用結合能≤-5.0kcal/mol作為結合有效指標。結果顯示，骨碎補總黃酮與LEP結合能≤-5.0kcal/mol的有效成分有6種，占總數的60%；與LEP結合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有8種，占總數的80%。采用Pymol2.4.0對有效成分與LEP、ADP對接結合能絕對值排名前三的結果進行可視化呈現，結果見圖1。

圖1 有效成分與靶點蛋白對接結果可視化呈現

2.3 各組大鼠BMD比較 與空白組比較，模型組大鼠BMD明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠BMD明顯升高（P<0.05），且中藥組大鼠BMD與西藥組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠骨密度（BMD）比較（±s，n=10）

2.4 各組大鼠血清E2、ADP、LEP水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清E2、ADP、LEP水平均明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，西藥組大鼠血清E2、LEP水平均明顯升高（P<0.01），而西藥組大鼠血清ADP水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；中藥組大鼠血清E2水平明顯升高（P<0.01），ADP水平明顯降低（P<0.01），而中藥組大鼠血清LEP水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與西藥組比較，中藥組大鼠血清E2、LEP、ADP水平均明顯降低（P<0.01）。（見圖3）

圖3 各組大鼠血清E2、ADP、LEP水平比較（±s，n=10）

3 討論

中醫學認為絕經后骨質疏松癥屬“骨痿”范疇，病位位于腎、脾二臟。絕經后骨質疏松癥的發生主要與腎虛和血瘀有關，其中腎虛是本病的主要原因。骨碎補是補腎藥的代表之一。骨碎補性溫，味苦，歸肝、腎經，具有補腎、壯骨、強筋、活血的功能。骨碎補總黃酮為其主要成分。課題組前期研究[7-8]證實，骨碎補總黃酮可通過升高BMP-2、Bcl-2、IGF-1等細胞因子的表達，延緩失用性骨質疏松癥模型大鼠BMD的降低。

成骨細胞與破骨細胞之間的動態平衡變化一直是研究骨組織新生修復、維持骨量的關鍵，兩種細胞分別來自BMSC及造血干細胞的分化[9]，同時BMSC也可以分化出脂肪細胞，隨之也伴隨著BMSC的成骨-成脂分化競爭機制。研究[10]顯示，脂肪細胞分泌的脂肪因子不僅可以參與調節成骨分化，還可以通過影響相關轉錄因子的表達，參與破骨細胞分化的啟動、分化進程，提示脂肪因子很可能通過多種途徑參與成骨-破骨平衡的調節。ADP是由脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，在成骨、破骨細胞表面均檢測到其相應的兩種受體ADP受體1和ADP受體2。而目前ADP對成骨細胞及破骨細胞增殖、分化、活性、功能的影響研究尚無統一定論，富集在骨骼局部的ADP和游離在外周血中的ADP對成骨、破骨細胞的影響也具有差異性[11]。早期研究發現ADP能通過影響OPG/RANK/RANKL信號通路的表達間接促進破骨細胞的分化及功能，同時能通過MAPK信號通路誘導成骨細胞的增殖和分化，影響成骨-破骨平衡的穩定，最終導致骨量的流失[12]。有學者通過分析臨床觀察數據后提出血清ADP水平升高與骨密度成負相關，而降低ADP的表達對降低PMOP的發生率有著積極作用[13]。動物實驗研究[14]證實，通過ADP受體抑制劑干預的小鼠骨骼再生速度更快，而脂肪生成速度減緩；敲除ADP基因小鼠的骨密度升高，骨組織內骨小梁數目增多，體內破骨細胞數量減少[10]，這與本次研究的結果一致。而重組ADP對ADP缺乏模型小鼠進行干預后，RANKL/OPG比值降低，破骨細胞分化數量減少[15]，值得注意的是，局部ADP的升高可以抑制成骨細胞的分化，導致骨密度降低[16]。LEP是一種由167個氨基酸組成的分泌型蛋白質，主要由白色脂肪組織產生。此外，骨髓中的脂肪組織也可以產生LEP。LEP是肥胖基因（Ob）的表達產物，在成骨、破骨細胞表面同樣可以檢測到其受體[17]。LEP可通過中樞和外周兩種途徑影響骨代謝：在外周，LEP一方面抑制脂肪細胞的形成并促進成骨細胞的分化，另一方面通過激活OPG/RANK/RANKL信號通路升高骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）含量，進而抑制破骨細胞的產生，最終對成骨-破骨平衡起到正向調節作用；在中樞，LEP通過興奮交感神經、促進去甲腎上腺素的釋放、增加RANKL的表達來促進破骨細胞的增殖分化，最終達到抑制骨形成的作用[18-21]。LIU X L等[22]在追趕生長（Catch-up growth，CUG）模型動物實驗中觀察到高脂飲食導致了骨量的嚴重減少，LEP的不足更是加重了骨量的丟失，且骨組織形態學上發生了嚴重病理變化。

分子對接計算結果顯示，骨碎補總黃酮中部分成分可以與ADP、LEP進行對接，且與ADP的結合活性相對較好。其中骨碎補苷A（Davallioside A_qt）與ADP結合能≤-7.0 kcal/mol，表明這一成分很可能是骨碎補總黃酮與ADP作用的主要成分。動物實驗中，經骨碎補總黃酮與阿侖膦酸鈉片干預的去勢大鼠BMD及E2的表達均高于模型組，但在對ADP和LEP的作用上表現出相反的結果。研究發現，多種補腎中藥復方可以通過抑制LEP啟動子的甲基化從而提高LEP的表達量以防治OP[23]，但在本次研究中并未觀察到LEP含量的上升，這可能與LEP主要在成骨細胞礦化期分泌合成而在成骨細胞成熟后消失有關[24]。本次分子對接結果及動物實驗結果顯示，在PMOP疾病進程中，大鼠血清ADP、LEP水平均明顯降低；骨碎補總黃酮可能通過改善E2分泌、降低ADP的表達，延緩BMD的流失來防治PMOP，但相關的機制仍需進一步進行探究。