PCA-TTC顯色法測(cè)定工業(yè)循環(huán)水中異養(yǎng)菌的實(shí)驗(yàn)研究

婁紅杰

（國(guó)能榆林化工有限公司，陜西 神木 719300）

異養(yǎng)菌是一種利用環(huán)境中的有機(jī)物進(jìn)行氧化發(fā)酵得到細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的菌種[1]。在工業(yè)循環(huán)冷卻水中，以異養(yǎng)菌的生長(zhǎng)繁殖最快，數(shù)量也最多，它基本上代表了水中全部細(xì)菌的數(shù)量[2]。可以說(shuō)是在循環(huán)冷卻水中具有指示性和代表性的細(xì)菌種類，這類細(xì)菌能產(chǎn)生致密的黏液，粘附水中細(xì)小的懸浮物及其他絲狀菌、霉菌、藻類和原生動(dòng)物等，從而形成黏泥，堵塞管道、腐蝕設(shè)備、影響換熱效率[3-4]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定循環(huán)水中異養(yǎng)菌含量對(duì)于控制微生物危害具有重要意義。我國(guó)工業(yè)循環(huán)冷卻水處理設(shè)計(jì)規(guī)范[5]要求異養(yǎng)菌監(jiān)控指標(biāo)小于等于1×105CFU/mL，通過(guò)對(duì)其監(jiān)測(cè)可以了解微生物危害的總趨勢(shì)。

目前，國(guó)內(nèi)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中異養(yǎng)菌的檢測(cè)方法，多采用標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)法[6-7]，即將待測(cè)水樣用10倍稀釋法稀釋至需要的稀釋度，用吸量管將不同稀釋度試樣1 mL分別接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將冷卻至（45±1）℃滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱NA，基本組成為蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%～2.0%）10～15 mL灌入培養(yǎng)皿內(nèi)，混合均勻；待固化后置于（29±1）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期滿后按照計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。但此方法主要存在兩方面問(wèn)題[8]，一是由于有些菌落微小或菌落蔓延，菌落與NA的反差不明顯（都呈現(xiàn)黃色），培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)氣泡，肉眼或放大鏡難于識(shí)別和計(jì)數(shù)的情況，易導(dǎo)致人為讀數(shù)誤差。二是此法所得的菌落數(shù)可能要低于其正常存活的活細(xì)胞的數(shù)目，檢出率低，檢測(cè)準(zhǔn)確度有待提高。

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱PCA，基本組成為胰蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.25%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.5%）是國(guó)際公認(rèn)的菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)基不但不會(huì)損害水中的微生物細(xì)胞，還能夠修復(fù)受損細(xì)胞并在不影響細(xì)菌本身的情況下促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖。筆者通過(guò)用PCA替代NA，并在PCA中加入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（又名紅四氮唑，以下簡(jiǎn)稱TTC），使細(xì)菌菌落長(zhǎng)成紅顏色，易于辨別，建立PCA-TTC顯色法測(cè)定水中異養(yǎng)菌含量，為循環(huán)冷卻水水質(zhì)監(jiān)控提供可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

密里博純水機(jī)：Milli-Q Advantage A10型，法國(guó)密理博公司。

超凈工作臺(tái)：含紫外燈，GAT-2DC型，濟(jì)南格艾特公司。

高壓蒸汽滅菌器；WAC-47型，韓國(guó)大韓公司。

生化培養(yǎng)箱：（0～50）℃±1℃，LRH-150F型，上海天呈有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱：溫度可控制在（60～280）℃±2℃，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器：icount 30型，杭州迅數(shù)有限公司。

電子分析天平：MSA224S-1CE-DU型，感量0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

2，3，5 -氯化三苯基四氮唑（TTC）：又名紅四氮唑，分析純，上海麥瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

市售平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）：生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

濃鹽酸：分析純，ρ=1.19 g/mL，北京化工廠。

氯化鈉：分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

硫代硫酸鈉：分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。將適量的硫代硫酸鈉放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，并均勻地?cái)傇陔x紫外燈30 cm處，滅菌30 min。脫除水樣中的余氯用。

醫(yī)用乙醇：75%（體積分?jǐn)?shù)），天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

牛皮紙：衡水凱盛源醫(yī)療器械有限公司。

醫(yī)用脫脂棉：衡水凱盛源醫(yī)療器械有限公司。

醫(yī)用脫脂紗布：衡水凱盛源醫(yī)療器械有限公司。

玻璃培養(yǎng)皿：d 90 mm，（160±2）℃滅菌2 h，四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。

刻度吸管：1 mL，5 mL，10 mL。（160±2）℃滅菌2 h。天津市天玻玻璃儀器有限公司。

試管：做鹽水管用，d 20 mm×200 mm，四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。

磨口試劑瓶：500 mL，天津市天玻玻璃儀器有限公司。做采樣瓶用，將洗凈并烘干后的500 mL磨口試劑瓶瓶口和瓶頸用牛皮紙包好，扎緊，置電熱干燥箱中，于（160±2）℃滅菌2 h。

搪瓷量杯：1 000 mL，廣西南寧融儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

錐形瓶：250 mL，500 mL，1 000 mL。天津市天玻玻璃儀器有限公司。

試驗(yàn)用水為超純水，由純水機(jī)直接制備。

1.2 溶液配制

TTC水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：0.5%，1.0%，2.0%。分別稱取0.5、1.0、2.0 gTTC，溶解于100 mL無(wú)菌水中，放于無(wú)菌棕色試劑瓶中，置于冰箱備用；

PCA-TTC培養(yǎng)基：稱取PCA瓊脂23.5 g，加入純水約950 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，趁熱用醫(yī)用脫脂棉和脫脂紗布過(guò)濾于搪瓷量杯中，用熱水補(bǔ)充至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，然后加入一定濃度的TTC水溶液1 mL，混勻，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

生理鹽水：0.85%，稱取8.5 g氯化鈉，溶解在1 000 mL水中。

無(wú)菌稀釋水：將生理鹽水分裝在試管中，每管9 mL，塞上棉塞，用牛皮紙把試管口包好，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

氫氧化鈉溶液：40 g/L，稱取40 g氫氧化鈉，溶于1 000 mL水中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同TTC濃度下PCA培養(yǎng)基的制備

配制5 000 mL的PCA瓊脂，并分成9份（3×100 mL、3×500 mL、3×1 000 mL），然后按照正交試驗(yàn)表分別對(duì)應(yīng)加入0.5%、1.0%、2.0%的TTC水溶液各1 mL，混勻，制備成不同TTC濃度下的PCA-TTC培養(yǎng)基，并分裝在不同錐形瓶中，塞上棉塞，用牛皮紙把瓶口包好，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

1.3.2 樣品選取

某煤制烯烴企業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)一循氧化型殺生劑連續(xù)投加的是三氯異氰尿酸+次氯酸鈉，非氧化型殺生劑沖擊投加的是異噻唑啉酮CW-8803。二循氧化型殺生劑連續(xù)投加的是活性溴（JH-714），非氧化型殺生劑沖擊投加的是異噻唑啉酮CW-8803和有機(jī)胍類，交替投加。選取一循和二循水樣進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 樣品測(cè)試

將待測(cè)試樣（硫代硫酸鈉脫氯后的）放入超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌操作，用10倍稀釋法稀釋至需要的稀釋度，用無(wú)菌吸量管將不同稀釋度試樣分別接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種2個(gè)皿，每皿接種1 mL，每接種一個(gè)稀釋度更換一支無(wú)菌吸管。將冷卻至（45±1）℃滅菌后的PCA-TTC培養(yǎng)基10～15 mL灌入培養(yǎng)皿內(nèi)，混合均勻。待固化后置于（29±1）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間，培養(yǎng)期滿后按照計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)做空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 TTC最適濃度的選擇

TTC是一種化學(xué)試劑，無(wú)色的TTC作為氫的受體，在細(xì)菌脫氫酶作用下，還原后成為紅色的三苯基甲月替，使菌落呈紅色[9]，培養(yǎng)基與菌落顏色反差明顯，能有效去除本底顆粒物、氣泡等干擾。因此常用于食品[10-11]、化妝品[12]、水[13]中等菌落顯色中。其不耐熱，一般與培養(yǎng)基使用時(shí)，都是用“過(guò)濾除菌”的方法來(lái)滅菌。TTC同時(shí)也具有抑菌性[14]，筆者利用其不耐熱的性質(zhì)，采用高溫高壓滅菌，并結(jié)合TTC水溶液適宜濃度，達(dá)到既能降低TTC抑菌性能又能顯色的目的。

考察因素A PCA用量（L）、因素B TTC水溶液濃度（%）、因素C培養(yǎng)時(shí)間（d）三個(gè)主要因素，根據(jù)3因素3水平，設(shè)計(jì)不交互正交試驗(yàn)[15]L9（34），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

按1.3實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)表1中各因素水平進(jìn)行測(cè)定，正交試驗(yàn)顯色和計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。其中試樣為一循+二循的混合水樣，每個(gè)稀釋度分別接種2個(gè)皿，培養(yǎng)基為經(jīng)過(guò)（121±1）℃高壓滅菌后的PCA-TTC培養(yǎng)基。混合水樣于NA平皿計(jì)數(shù)法異養(yǎng)菌測(cè)定結(jié)果為9.6×103CFU/mL。

表2 正交試驗(yàn)顯色和計(jì)數(shù)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果采用數(shù)據(jù)直觀分析[16]，并結(jié)合菌落生長(zhǎng)顏色和PCA-TTC培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌后是否變色，尋找最佳因子組合，確定優(yōu)方案，選擇TTC最適濃度。

從表2可以看出，各因素極差RA＞RC＞RB，所以各因素的從主到次的順序?yàn)锳，C，B。不同濃度的TTC水溶液1 mL加入到PCA瓊脂中，制備的PCA-TTC培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌后，有4種培養(yǎng)基變成紫紅或紅色，培養(yǎng)基變色不可取。首選不變色的培養(yǎng)基，在其余5種不變色的培養(yǎng)基中，再優(yōu)選生長(zhǎng)成紅色菌落所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，易于識(shí)別。二次篩選后，只有A2B2C3和A3B3C2兩種方案菌落顏色為紅色。2種方案對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中的B/A值均為0.002%（相當(dāng)于2%的TTC水溶液1 mL加入到1 000 mL培養(yǎng)基中或1%的TTC水溶液1 mL加入到500 mL培養(yǎng)基中）。A2B2C3和A3B3C2 2種方案的PCA-TTC顯色法，異養(yǎng)菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果分別為1.3×104CFU/mL（3 d）和1.2×104CFU/mL（2 d），經(jīng)t值檢驗(yàn)，雖然都與傳統(tǒng)NA平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果9.6×103CFU/mL（3 d）無(wú)顯著差異，但均高于NA平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明PCA-TTC顯色法能對(duì)受損細(xì)菌恢復(fù)并進(jìn)行有效促進(jìn)，便于菌落生長(zhǎng)、識(shí)別和計(jì)數(shù)。

考慮到不同因素對(duì)異養(yǎng)菌含量的影響程度，通過(guò)綜合平衡法確定優(yōu)方案，具體平衡過(guò)程如下。

因素A和B：對(duì)異養(yǎng)菌含量來(lái)說(shuō)，B/A值（TTC顯色劑在培養(yǎng)基中的濃度）不可過(guò)小也不可過(guò)大。結(jié)合顏色，本著提高工效原則，所以取B2/A2或B3/A3為最佳水平。

因素C：對(duì)異養(yǎng)菌含量來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)時(shí)間（d）水平越大越好。所以取C3為最佳水平。

綜合上述分析，確定優(yōu)方案為A2B2C3或A3B3C3，且B2/A2=B3/A3=0.002%，其中A2B2C3方案正好是正交表中的第5號(hào)試驗(yàn)，其是已作過(guò)的9個(gè)試驗(yàn)中異養(yǎng)菌菌落長(zhǎng)成紅顏色、異養(yǎng)菌含量最多的試驗(yàn)方案，因此也是最優(yōu)方案，即TTC在培養(yǎng)基中的最適濃度為0.002%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

2.2 精密度試驗(yàn)

分別取不同時(shí)段的一循和二循循環(huán)水水樣，按照PCA-TTC顯色法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品/稀釋度，使用2個(gè)平行皿，同時(shí)做空白對(duì)照，根據(jù)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行報(bào)告，報(bào)告結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，用PCA-TTC顯色法檢測(cè)循環(huán)水樣品中異養(yǎng)菌，每個(gè)樣品/稀釋度下的平行皿菌落數(shù)，置信度達(dá)到95%時(shí)，經(jīng)t值檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果彼此間均無(wú)顯著差異，滿足原標(biāo)準(zhǔn)分析質(zhì)控要求。

其中例次1和2，按照HG/T 4207—2011《工業(yè)循環(huán)冷卻水異養(yǎng)菌菌數(shù)測(cè)定平皿計(jì)數(shù)法》中的選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，立即進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得平均菌落數(shù)，并修約成兩位有效數(shù)字，報(bào)告結(jié)果分別為一循1.3×105CFU/mL和二循8.9×104CFU/mL。例次3和4，按照HG/T 4207—2011《工業(yè)循環(huán)冷卻水異養(yǎng)菌菌數(shù)測(cè)定平皿計(jì)數(shù)法》計(jì)數(shù)方法中的若有2個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)菌落數(shù)均在30～300之間，則視二者之比值來(lái)決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字。例次3和4均屬于比值大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字情況，因此報(bào)告結(jié)果分別為一循2.7×103CFU/mL和二循2.6×105CFU/mL。

2.3 對(duì)比和驗(yàn)證試驗(yàn)

在TTC最適濃度（0.002%）下，將一循和二循水樣各30份，分別用PCA-TTC顯色法與NA平皿計(jì)數(shù)法培養(yǎng)3 d，每個(gè)稀釋度分別接種2個(gè)平行皿，測(cè)定異養(yǎng)菌含量，根據(jù)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行報(bào)告，并按照監(jiān)控指標(biāo)（小于等于1×105CFU/mL）進(jìn)行判定是否合格。一循2種方法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，二循2種方法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，歸納總結(jié)表4和表5數(shù)據(jù)，2種測(cè)定方法的結(jié)果比較見(jiàn)表6。

從表4、表5和表6可知，一循PCA-TTC顯色法合格異養(yǎng)菌數(shù)份數(shù)28例，取得93.33%的合格率；NA平皿計(jì)數(shù)法合格異養(yǎng)菌數(shù)份數(shù)29例，取得96.67%的合格率。二循PCA-TTC顯色法合格異養(yǎng)菌數(shù)份數(shù)27例，取得90.00%的合格率；NA平皿計(jì)數(shù)法合格異養(yǎng)菌數(shù)份數(shù)29例，取得96.67%的合格率。2種檢測(cè)方法測(cè)定異養(yǎng)菌，經(jīng)卡方檢驗(yàn)[17]，P＞0.05，2種方法雖均無(wú)顯著差異，但PCA-TTC顯色法檢出率高于NA平皿計(jì)數(shù)法，說(shuō)明PCA-TTC顯色法更適合循環(huán)水異養(yǎng)菌生長(zhǎng)，準(zhǔn)確度更高，可以替代NA平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定異養(yǎng)菌。

表4 一循2種方法測(cè)定結(jié)果

表5 二循2種方法測(cè)定結(jié)果

表6 2種測(cè)定方法的結(jié)果比較

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)異養(yǎng)菌結(jié)果的影響

異養(yǎng)菌的培養(yǎng)時(shí)間規(guī)定為72 h，由于PCA瓊脂具有修復(fù)和促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)作用，因此可以縮短培養(yǎng)時(shí)間。用PCA-TTC顯色法分別測(cè)定一循[8.0×103CFU/mL（72 h）]和二循[2.2×104CFU/mL（72 h）]水樣中異養(yǎng)菌含量。培養(yǎng)48 h后，每隔3 h/次計(jì)數(shù)，觀察異養(yǎng)菌的增長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，在培養(yǎng)66 h的時(shí)候一循和二循都達(dá)到了平臺(tái)期，而72 h時(shí)異養(yǎng)菌總數(shù)已經(jīng)很穩(wěn)定，所以選擇66 h作為培養(yǎng)時(shí)間就可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)異養(yǎng)菌測(cè)定結(jié)果的影響

3 結(jié)論

（1）建立PCA-TTC顯色法測(cè)定異養(yǎng)菌，不僅對(duì)受損細(xì)菌恢復(fù)并進(jìn)行有效促進(jìn)，還能加快計(jì)數(shù)速度，并縮短培養(yǎng)時(shí)間，由原來(lái)的72 h縮短至66 h，省時(shí)省力，提高工效。

（2）與標(biāo)準(zhǔn)NA平皿計(jì)數(shù)法對(duì)比，2種方法雖無(wú)顯著差異，但PCA-TTC顯色法檢出率高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可靠性有效提升，可以替代標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定異養(yǎng)菌。滿足工業(yè)循環(huán)冷卻水水質(zhì)檢測(cè)、水質(zhì)控制和殺菌劑評(píng)定性能等方面的實(shí)際工作需求，可適用于工業(yè)循環(huán)冷卻水、原水、生活用水及其他水中異養(yǎng)菌菌數(shù)的測(cè)定。

（3）在普遍認(rèn)為TTC不適合高溫高壓滅菌的前提下，筆者通過(guò)控制TTC溶液濃度（0.002%），配合高溫高壓滅菌，降低了TTC滅菌操作難度和抑菌性，取得了良好的技術(shù)效果，具有一定的應(yīng)用前景。