NaCl對兔肉蛋白質氧化的影響

何琪，董怡，鄧莎，向燕，何培君，何強

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

兔肉是一種健康又經濟的肉類，含有豐富的多不飽和脂肪酸、蛋白質、必需氨基酸等營養成分，蛋白質含量高達70%，具有低脂肪、低熱量、低膽固醇的特點[1-2]。基于以上優點，兔肉產品在近十年來得到了迅速的發展，受到消費者的青睞。

腌制是肉類及肉制品加工和保鮮中廣泛使用的一種方法，具有提高肉質風味、嫩化等作用[3]。NaCl是腌制肉的基礎用料，能夠賦予肉制品更好的口感；提高肉制品的保藏性。在肉制品中添加鹽還可以提高肉的保水能力，提高肉制品的風味，抑制有害微生物的生長和繁殖[4]。然而，在腌制過程中還會發生氧化和蛋白質變性等化學反應，肉品腌制過程中發生的脂質和蛋白質氧化反應是導致肉及肉制品劣變的主要非微生物因素[5]。兔肉因富含不飽和脂肪酸容易發生氧化反應，添加NaCl也會促進脂肪氧化，脂質氧化的次級產物進一步與蛋白質、多肽和氨基酸發生反應，促進蛋白質氧化，從而破壞其功能特性，肉制品的營養價值降低[6]。

兔肉的氧化程度會影響其保質期，并受兔肉的內在性質和外部因素的影響。在肉制品生產加工過程中，絞碎、腌制、烹飪等步驟會促使活性氧(ROS)的產生，ROS能夠攻擊蛋白質發生一系列鏈式反應，從而誘導蛋白質氧化,修飾其骨架和側鏈，導致蛋白質結構和功能的改變[7]。肉制品蛋白質結構的改變會影響氨基酸的利用率，較溫和的氧化過程使得蛋白質結構展開，蛋白水解酶可以與底物結合，然而嚴重的氧化過程會使蛋白質聚合，結構更加緊密，從而導致結合位點的改變，降低蛋白水解酶的作用效果[8]。蛋白質氧化會影響肉制品的質地、口感、風味、可接受度和營養價值，因此控制好蛋白質氧化程度才能讓產品質量保持在較好的水平。

目前關于兔肉蛋白質氧化與NaCl之間的關系研究較少，本實驗以兔肉作為研究對象，通過添加不同質量濃度的NaCl對兔肉進行腌制處理，進一步探究NaCl對腌制過程中兔肉蛋白質氧化的影響，為提高腌制兔肉的品質、延長產品貯藏期提供了相關理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮兔肉購自四川省成都市當地市場，平均質量約1.7 kg，取兔后腿作為實驗材料。

NaCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、無水乙醇、乙酸乙酯、尿素、2-硝基苯甲酸、氯化鎂、乙二胺四乙酸二鈉、溴酚藍:均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；牛血清蛋白：生化試劑，上海如吉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SQP電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;1736R高速冷凍離心機 ScanSpeed公司；JRJ300-D-1勻漿機 上海滬析實業有限公司；HH-1A恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;SHA-C水浴振蕩器 金壇市科析儀器有限公司;FiveEasy Plus pH計 德國梅特勒-托利多公司;F-7000熒光分光光度計 日本日立公司;MCR 302流變儀 奧地利安東帕(中國)有限公司;UV-6000PC 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取一定量兔后腿，剔骨留下肌肉部分，除去脂肪和肌膜，將兔肉切成約2 cm×3 cm×2 cm的立方體后分為6組，分別加入0%、3%、6%、9%、12%、15%的NaCl混合均勻，放入4 ℃的冰箱中腌制48 h。

1.3.2 蛋白質提取

參考Zhang等[9]的方法，并進行適當的修改。取10 g兔肉絞碎，加入40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0，100 mmol/L的NaCl、2 mmol/L的MgCl2和1 mmol/L的EDTA-2Na)。然后在冰浴下以8000 r/min均質1 min，用紗布過濾后得到總的蛋白溶液。以牛血清蛋白為標準，用雙縮脲法測定蛋白質的濃度。

1.3.3 羰基含量測定

參考Wang等[10]的方法，并進行適當的修改。用20 mmol/L的PBS (pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。從每組樣品中取兩份400 μL的稀釋液，其中一份用800 μL含0.2% 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L鹽酸處理，另一份用800 μL的2 mol/L鹽酸處理。樣品在室溫下反應30 min后，加入三氯乙酸(0.4 g/mL)400 μL，混合物于4 ℃離心(5000 r/min, 5 min)，除去上清液。然后加入1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液(1∶1，體積比)與沉淀物混合，隨后在4 ℃、5000 r/min條件下離心5 min，重復洗滌3次。加入1.5 mL含有6 mol/L鹽酸胍的PBS(20 mmol/L，pH 6.5)溶解沉淀。放置過夜后，在370 nm波長處測定吸光度，根據摩爾消光系數22000 L/(mol·cm)計算求得，公式如下：

式中：A表示在370 nm波長處的吸光度值；C表示蛋白質的質量濃度，mg/mL；n表示稀釋倍數。

1.3.4 巰基含量測定

參考Wang等的方法，并進行適當的修改。用PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。取1 mL樣品溶液，用9 mL PBS(50 mmol/L，pH 7.0，含8 mol/L尿素，0.6 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA-2Na)稀釋。然后取3 mL稀釋后的溶液與0.4 mL 0.1%的2-硝基苯甲酸混合，在40 ℃下避光靜置25 min。冷卻至室溫后在412 nm波長處測量吸光度，巰基含量計算公式如下：

式中：A表示在412 nm波長處的吸光度值；C表示蛋白質的質量濃度，mg/mL；n表示稀釋倍數。

1.3.5 表面疏水性測定

參考Zhang等的方法，并進行適當的修改。用PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。將1 mL稀釋液與0.2 mL溴酚藍溶液(BPB，1 mg/mL)混合。對照組加入PBS 1 mL，BPB溶液0.2 mL。所有樣品于25 ℃搖勻10 min，然后于4 ℃、2000×g離心15 min。離心后取上清液0.4 mL，加入PBS(20 mmol/L, pH 6.0)3.6 mL稀釋，在595 nm處測定吸光度。蛋白表面疏水性的計算公式如下:

1.3.6 紫外吸收光譜測定

參考Wang等[11]的方法。用 PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至0.5 mg/mL，在室溫下記錄230～320 nm稀釋溶液的吸收光譜。PBS(20 mmol/L，pH 6.0)為空白。

1.3.7 內源熒光光譜測定

參考Wang等的方法。用20 mmol/L的PBS(pH 6.0)稀釋樣品至0.5 mg/mL，使用熒光分光光度計在激發波長為295 nm的條件下，記錄在300～400 nm之間的發射光譜，電壓為700 V。

1.3.8 流變學特性測定

將樣品稀釋至15 mg/mL，測定其流變學特性。流變儀的測定條件：測試溫度25 ℃，頻率0.1 Hz，剪切速率0.1～100 s-1。

1.4 數據處理

實驗數據的方差分析采用SPSS 26.0軟件進行，顯著性分析采用Duncan's多重比較，在p<0.05時為差異顯著，使用Origin 2021軟件進行繪圖。所有實驗重復3次，樣品至少設置3組重復。

2 結果與討論

2.1 NaCl對蛋白質巰基和羰基含量的影響

巰基含量是評判蛋白質氧化程度的重要指標，蛋白質氧化程度越高，巰基含量越少。羰基是蛋白質氧化的另一重要生成物，也可以反映蛋白質的氧化程度[12]。NaCl對兔肉蛋白質羰基和巰基含量的影響見圖1。

圖1 NaCl添加量對兔肉蛋白質巰基和羰基含量的影響

由圖1可知，未加NaCl的兔肉蛋白巰基含量最高，而添加NaCl后，兔肉蛋白中巰基的含量顯著下降(p<0.05),下降了約20%。隨著NaCl添加量的增加，兔肉蛋白中羰基含量顯著上升(p<0.05)，最大值達到5.03 nmol/mg，這與Zhao等[13]結果保持一致，NaCl能夠顯著促進蛋白質的氧化，加速兔肉蛋白質中巰基的損失和羰基的形成。兔肉蛋白質巰基含量下降的原因是半胱氨酸中巰基基團氧化轉化為二硫鍵和半胱氨酸含氧酸，二硫鍵的形成會導致蛋白質分子間或分子內的交聯[14]。同時，兔肉在腌制后會釋放一些血紅素，從而促進過渡金屬如Fe2+、Fe3+參與反應，蛋白質則可以通過金屬催化氧化(MCO)途徑形成ROS進一步羰基化。由于鏈式反應的活化能較高，反應開始較慢，隨后蛋白質迅速氧化，并在精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的側鏈產生羰基[15]。脂質氧化產物與蛋白質形成的加合物也可形成蛋白質羰基化，如丙二醛、4-羥基壬烯醛等。

2.2 NaCl對蛋白質表面疏水性的影響

蛋白質能夠維持三級結構的要素是疏水基團之間存在一種非共價鍵作用力，絕大多數非極性氨基酸側鏈都隱藏在蛋白質內部，而部分非極性基團會暴露在蛋白質分子表面，具有疏水性[16]。溴酚藍與蛋白質分子表現出良好的疏水相互作用，通過二者的結合量可以反映蛋白質的構象變化，以此判斷氧化變性程度[17]。NaCl對兔肉蛋白質表面疏水性的影響見圖2。

圖2 NaCl添加量對兔肉蛋白質表面疏水性的影響

由圖2可知，不添加NaCl的兔肉組別表面疏水性最弱，僅為38.76 μg，隨著NaCl添加量的增加，蛋白質表面疏水性顯著增強(p<0.05)，而在NaCl添加量為9%以上時蛋白質表面疏水性增加的不明顯(p>0.05)。NaCl添加量為9%以下時，NaCl破壞了蛋白質親水基團和疏水基團的平衡，蛋白質三級結構展開，構象發生劇烈的改變，隱藏在蛋白質內部的疏水基團暴露出來，所以蛋白質的表面疏水作用顯著增強[18]。隨著NaCl添加量的進一步增加，兔肉蛋白疏水性變化不顯著，可能是高鹽抑制了蛋白質的疏水和二硫鍵作用，也可能是過度氧化導致蛋白質通過疏水相互作用發生聚集，使得表面疏水性的增加有所減弱。

2.3 NaCl對蛋白質紫外吸收光譜的影響

蛋白質中含有芳香環結構的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基具有紫外吸收特性，所以紫外吸收光譜可以反映芳香族氨基酸側鏈的變化，從而揭示蛋白質的構象變化。不同NaCl添加量下兔肉蛋白質的紫外吸收光譜見圖3。

圖3 NaCl添加量對兔肉蛋白質紫外吸收光譜的影響

由圖3可知，經過不同添加量NaCl腌制處理后，兔肉蛋白質紫外吸收光譜趨勢相似，都在280 nm處出現了峰的拐點。由此可知，NaCl對兔肉蛋白質有促氧化作用，但是氧化不會改變蛋白質的整體結構，隨著NaCl添加量的增加，蛋白質的吸收峰輕微下降。Zhang等研究發現，蛋白質的最大紫外吸收峰隨著氧化強度的增大而減小，這是因為蛋白質表面酪氨酸和色氨酸殘基的氧化修飾作用。酪氨酸容易被ROO·攻擊，在雜原子取代物處發生氫原子提取反應，然后產生酪氨酸苯氧基，兩個酪氨酸自由基發生偶聯，并進一步通過共價鍵生成二聚酪氨酸。色氨酸殘基也會發生類似的反應，從而增強分子內或分子間的蛋白質交聯。

2.4 NaCl對兔肉蛋白質內源熒光強度的影響

內源熒光光譜通常用來表征蛋白質構象的變化。不同NaCl添加量下兔肉蛋白質的內源熒光強度見圖4。

圖4 NaCl添加量對兔肉蛋白質內源熒光強度的影響

由圖4可知，添加NaCl之后，兔肉蛋白質的內源熒光強度有所降低，當NaCl添加量為9%時熒光強度最低，并發生了輕微的紅移，說明NaCl有促進兔肉蛋白質氧化的作用。這可能是因為氧化會導致蛋白質結構發生變化，蛋白質空間結構展開，暴露了內部疏水結構的色氨酸殘基，色氨酸具有較高的熒光強度，當蛋白質展開、色氨酸暴露于外部環境時熒光強度反而會降低，這與趙亞南等[19]的研究結果相似。

2.5 NaCl對蛋白質流變學特性的影響

NaCl對兔肉蛋白質剪切應力的影響變化曲線見圖5。

由圖5可知，不同NaCl添加量的兔肉蛋白質剪切應力隨著剪切速率的增大而增大。在低剪切速率階段，蛋白質溶液的剪切應力幾乎呈線性上升的趨勢，蛋白質溶液表現出牛頓流體的性質，這是因為蛋白質的高分子鏈段在剪切速率較低時沒有表現出黏彈性形變。在相同的剪切速率下，添加NaCl的樣品剪切應力高于未添加NaCl的樣品，且在添加量為6%時達到最大。這可能是由于鹽能促進肌原纖維蛋白的溶解，形成致密的三維網絡，蛋白質與蛋白質之間的作用力得以增強，在低鹽環境下肌球蛋白間有較強的作用力，如氫鍵、離子鍵等，降低了溶液的流動性，所以需要更大的剪切應力[20]。而高鹽會導致蛋白質過度氧化并發生聚集現象，分子間作用力有所降低。

圖5 NaCl添加量對兔肉蛋白質流變學特性的影響

3 結論

本研究通過添加不同質量濃度的NaCl腌制兔肉，以探討NaCl對兔肉蛋白質氧化的影響。結果表明，隨著NaCl添加量的增加，兔肉蛋白質中巰基含量降低了約20%，羰基含量升高至5.03 nmol/mg，表面疏水性得到增強，表明NaCl作為促氧化劑使蛋白質氧化程度有所增加。不同NaCl添加量腌制處理后的兔肉蛋白質紫外吸收光譜相似，都在280 nm處出現了峰的拐點，而隨著NaCl添加量的增加，蛋白質的紫外最大吸收峰會略微下降。添加NaCl后，兔肉蛋白質的內源熒光強度也有降低的現象，在添加量為9%時熒光強度最低，并發生了輕微的紅移，這說明NaCl的促氧化作用導致蛋白質結構發生變化。兔肉的肌原纖維蛋白在NaCl的作用下溶解，蛋白溶液的流動性減弱，剪切應力增大，且在NaCl添加量為6%時最大，而高鹽腌制的兔肉蛋白質發生聚集，分子間作用力減小，導致剪切應力減小。總體而言，NaCl會促進蛋白質的氧化，但是高鹽會導致蛋白質過度氧化，蛋白質的結構和性質發生改變，降低兔肉的食用品質，所以在實際生產中要注意調控鹽的用量。