八角茴香三萜類化合物分離及其生物活性研究

孔馨逸，江大海，王潔

(1.西京學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，西安 710123；2.陜西步長(zhǎng)高新制藥有限公司，西安 710119；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

八角茴香是八角屬植物的果實(shí)，又被稱為八角、大料和大茴香[1]。其干燥成熟的果實(shí)中主要含有芳香油、脂肪油、蛋白質(zhì)和樹(shù)脂等[2]，是我國(guó)具有特色的香辛料，它具有健胃止嘔、祛痰鎮(zhèn)痛的功效，主要分布在我國(guó)的云南、貴州、廣西等地。八角茴香是較好的天然香料和調(diào)味品，在中國(guó)、印度等國(guó)家被廣泛地用于去除食品中的腥味[3]。

八角茴香作為食品，能直接用于調(diào)味或當(dāng)作香料加入食品中。品質(zhì)較好的八角茴香中具有特殊的香氣和甜味，用途廣泛，使用方便。八角茴香精油也具有抑菌作用，能夠作為食品防腐劑被使用，具有無(wú)副作用且能保持天然食品風(fēng)味的優(yōu)點(diǎn)。八角茴香中具有多種生物活性成分，主要包括茴香酮、茴香醛和茴香三萜，這些活性成分具有多種生物活性物質(zhì)的特點(diǎn)[4]。

近些年的研究結(jié)果表明，一些小分子中的萜類也具有明顯的生物活性功能[5]。自然狀態(tài)下的萜類物質(zhì)難溶于水，易溶于極性較低的有機(jī)溶劑，例如甲醇和乙醇。目前，常見(jiàn)的提取三萜類化合物的方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界二氧化碳萃取法[6]。溶劑提取法提取效率低，需要的溶劑量大，但操作簡(jiǎn)單、成本低[7]；超聲波輔助提取法具有效率高、耗時(shí)短、所需溶劑少等優(yōu)點(diǎn)；微波輔助提取法具有穿透力強(qiáng)、加熱快、加熱均勻、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[8]；超臨界二氧化碳萃取法具有無(wú)毒、操作流程簡(jiǎn)單、效率高、能最大限度地保護(hù)生物活性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[9]。

三萜類物質(zhì)具有多種生物活性和藥理功效，特別是在抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等方面具有藥用功效[10]。大量的試驗(yàn)和研究結(jié)果表明，許多三萜類化合物能明顯地抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)[11]。

目前，國(guó)內(nèi)八角茴香中三萜類物質(zhì)的提取和抗腫瘤活性的研究報(bào)道相對(duì)較少。所以，本研究通過(guò)采用超聲波輔助法對(duì)八角茴香中的三萜類物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)體外的抗腫瘤活性的分子機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為八角茴香中三萜類成分的利用和綜合開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

八角茴香：采集于云南普洱哀牢山，用粉碎機(jī)粉碎，待用。

植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；恒溫箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；干燥箱 上海一恒科技有限公司；分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；細(xì)胞儀 Beckman Coulter公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 八角茴香三萜提取工藝流程

稱取八角茴香粉末于提取器皿中，加入適量的乙醇溶液，在一定的濃度、溫度和固液比例條件下提取一定時(shí)間，冷卻、過(guò)濾、壓縮干燥后獲得八角茴香三萜[12]。

八角茴香→超聲波輔助提取→過(guò)濾→減壓濃縮→真空干燥→八角茴香三萜乙醇提取物。

1.2.2 八角茴香三萜濃度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取八角茴香粉末1 g于試管中，加入0.1 mL的乙醇溶液，塞上試管塞，在70 ℃的條件下水浴，待溶劑揮發(fā)，加入0.2 mL 5%的香草醛溶液，搖勻，再加入0.8 mL的高氯酸充分地?fù)u勻，在70 ℃的條件下水浴20 min后迅速冷卻至室溫，使用乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻，在波長(zhǎng)551 nm處測(cè)定吸光值[13]。

1.2.3 超聲輔助法提取八角茴香三萜工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)分析

稱取干八角茴香粉1 g，控制乙醇濃度70%、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度40 ℃和液固比例20∶1。改變其中1個(gè)參數(shù)，保持其他3個(gè)參數(shù)不變，分別改變乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min，超聲溫度為50，55，60，65，70 ℃，液固比例為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響較為顯著的3個(gè)因素(乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度)進(jìn)行優(yōu)化，獲取八角茴香三萜提取的最佳工藝參數(shù)，見(jiàn)表1。

表1 八角茴香三萜類化合物提取正交試驗(yàn)

1.2.4 八角茴香三萜對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用研究

1.2.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT溶液的配制(5 mg/mL)：稱取MTT 0.5 g，溶解于100 mL的D-Hanks溶液中，通過(guò)0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將其放于4 ℃的冰箱中保存待用[14]。

1.2.4.2 MTT檢測(cè)方法

將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以每個(gè)孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板上，放置在37 ℃的恒溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，控制空氣中的二氧化碳濃度為5%，培養(yǎng)12 h；添加不同濃度的八角茴香三萜；細(xì)胞處理的時(shí)間到達(dá)后，再添加20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；除去上清液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)10 min；在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助法提取八角茴香中三萜工藝研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 乙醇濃度對(duì)八角茴香三萜得率的影響

由圖1可知，八角茴香中三萜得率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，八角茴香中三萜得率最高，為8.1 mg/g。當(dāng)乙醇濃度為50%～70%時(shí)，八角茴香中三萜得率隨著乙醇濃度的增加而升高；當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，八角茴香中三萜得率隨著乙醇濃度的增加而降低。這是由于乙醇濃度過(guò)低，溶液中的水溶性物質(zhì)較多，影響了八角茴香中三萜得率。而當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，三萜類物質(zhì)中的極性基團(tuán)、羥基和羧基與乙醇溶液呈現(xiàn)一定的極性[15-16]。所以，乙醇濃度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)影響八角茴香中乙醇的提取。綜上，當(dāng)八角茴香提取的乙醇濃度為70%時(shí)，三萜提取效果最好。

圖1 乙醇濃度對(duì)八角茴香三萜得率的影響

2.1.1.2 超聲溫度對(duì)八角茴香三萜得率的影響

由圖2可知，隨著超聲溫度的升高，八角茴香中三萜得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時(shí)，八角茴香三萜的得率最高，為9.0 mg/g；當(dāng)超聲溫度為60～70 ℃時(shí)，八角茴香中的三萜物質(zhì)隨著超聲溫度的升高而降低。這是由于當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，反應(yīng)體系中的分子運(yùn)動(dòng)速度緩慢，不利于三萜的析出[17]；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)體系中的八角茴香三萜受到破壞，從而降低了八角茴香三萜的得率。

圖2 超聲溫度對(duì)八角茴香三萜得率的影響

2.1.1.3 超聲時(shí)間對(duì)八角茴香三萜得率的影響

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間大于40 min時(shí)，三萜得率的變化并不明顯。當(dāng)超聲時(shí)間小于40 min時(shí)，八角茴香中三萜的得率隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)而迅速升高。這是由于當(dāng)超聲時(shí)間小于40 min時(shí)，超聲能夠增加溶液中分子運(yùn)動(dòng)速率，從而加大八角茴香中三萜的得率，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，反應(yīng)體系中由于設(shè)備的溫度迅速升高，破壞了已經(jīng)提取的八角茴香中的三萜[18]。所以，選取超聲提取時(shí)間40 min作為最優(yōu)的八角茴香三萜提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)八角茴香三萜得率的影響

2.1.1.4 液固比例對(duì)八角茴香三萜得率的影響

由圖4可知，八角茴香中三萜的得率隨著液固比例的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)液固比例為20∶1時(shí)，八角茴香中三萜的得率最高，為8.0 mg/g。當(dāng)液固比例超過(guò)20∶1時(shí)，八角茴香中三萜的得率呈現(xiàn)緩緩下降的趨勢(shì)。這是由于當(dāng)液固比例小于20∶1時(shí)，增大液固比例能夠增加反應(yīng)體系中溶液的濃度。

圖4 液固比例對(duì)八角茴香三萜得率的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

選取A(乙醇濃度)、B(超聲時(shí)間)和C(超聲溫度)作為變量，以八角茴香三萜得率為響應(yīng)值，進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及八角茴香三萜得率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

由表2可知乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)八角茴香中三萜得率的影響情況，其中乙醇濃度的影響最明顯，其次是超聲時(shí)間，影響最不明顯的是超聲溫度，即A>B>C。八角茴香中三萜得率的最優(yōu)條件為A0B1C1，即乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為60 min和超聲溫度為40 ℃。

2.2 MTT法檢測(cè)八角茴香三萜對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

將4種癌細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞)分別接種至96孔板并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%的匯合度時(shí)，分別添加濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL的八角茴香三萜處理36 h。使用MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，由表3可知，八角茴香三萜對(duì)4種癌細(xì)胞均存在抑制作用，乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞抑制的最小八角茴香三萜濃度為0.3 mg/mL，宮頸癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞抑制的最小八角茴香三萜濃度為0.2 mg/mL。隨著八角茴香三萜濃度的增大，其對(duì)4種癌細(xì)胞的抑制效果都明顯增強(qiáng)。說(shuō)明八角茴香三萜對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用，但存在濃度的依賴性，不同種類的腫瘤細(xì)胞的最小作用濃度存在一定的差異[19-20]。

表3 不同的八角茴香三萜濃度對(duì)4種癌細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響

3 結(jié)論

八角茴香果實(shí)干燥之后能夠入藥，具有理氣、健胃止嘔、祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛等功效，是我國(guó)典型藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物。八角茴香精油在食品工業(yè)、飲料業(yè)、化妝品和制造業(yè)方面具有廣泛的用途。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，八角茴香中的三萜成分也開(kāi)始被研究人員關(guān)注。本研究基于此，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)八角茴香三萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳八角茴香三萜提取工藝為乙醇濃度60%、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度40 ℃和液固比例20∶1。同時(shí)研究結(jié)果也表明八角茴香三萜具有一定的抗腫瘤作用。