四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸及細(xì)菌解析

張雅琳，李婧,2，劉廷銳，朱文優(yōu)*，許慧

(1.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000; 2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

食醋是生活中必不可少的調(diào)味品，賦予食物鮮味、酸味、咸味等滋味。此外，食醋還具有抗氧化、降血糖和抑菌等效果。四川麩醋生產(chǎn)工藝常采用生麥麩為原材料，藥醋曲作為發(fā)酵劑，主要通過(guò)糖化、酒化和醋化3個(gè)工藝發(fā)酵而成。

食醋的酸味是其最具代表性的感官特征，研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸是食醋酸味的重要來(lái)源，能直接影響食醋的感官和品質(zhì)。有機(jī)酸主要分為揮發(fā)性有機(jī)酸和難揮發(fā)性有機(jī)酸，其中揮發(fā)性有機(jī)酸主要以乙酸為主體，而難揮發(fā)性有機(jī)酸能調(diào)和乙酸的刺激氣味，用于調(diào)和食醋的口感[1]。研究學(xué)者李俊雯[2]對(duì)鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建紅曲老陳醋和四川保寧醋中的有機(jī)酸種類(lèi)和分布進(jìn)行了研究，確定了有機(jī)酸對(duì)食醋呈味的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，乙酸對(duì)醋的酸澀味貢獻(xiàn)最大，丙酸次之；杜宏福[3]研究了山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的產(chǎn)生規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在醋醅發(fā)酵過(guò)程中，食醋中的主要有機(jī)酸為乙酸和乳酸，其中乙酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增長(zhǎng)；紀(jì)鳳娣等[4]采用離子色譜法分析鎮(zhèn)江香醋中乳酸、乙酸等有機(jī)酸的含量，研究發(fā)現(xiàn)食用醋中有機(jī)酸主要來(lái)源于乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)產(chǎn)生的乳酸和醋酸桿菌屬(Acetobacterspp.)產(chǎn)生的乙酸[5-6]。目前對(duì)食醋的研究多集中于對(duì)揮發(fā)性有機(jī)酸香氣成分的分析以及對(duì)有機(jī)酸含量的定量分析，但是對(duì)食醋中有機(jī)酸組成以及細(xì)菌與有機(jī)酸生成相關(guān)性的研究較少。本研究對(duì)四川麩醋醋醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸和主要產(chǎn)酸菌屬變化進(jìn)行研究，以期為提高四川麩醋風(fēng)味、優(yōu)化菌群提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原材料

四川麩醋醋醅：四川宜賓思坡醋廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1220 Infinity LC高效液相色譜儀、GC6890N-MSD5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)有限公司；AE224C電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Target-H色譜柱 美國(guó)MS科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

采集發(fā)酵第1，5，9，13，17，21天的醋醅，分別在醋醅的上層、中層、下層和四周進(jìn)行取樣，混合均勻后作為一個(gè)樣品，放置于無(wú)菌密封的采樣袋中，置于-80 ℃冰箱中保藏待測(cè)。

1.3.2 總酸的測(cè)定

參考GB/T 12456-2021[7]中的方法測(cè)定醋醅中的總酸含量。

1.3.3 揮發(fā)性酸的測(cè)定

參照劉廷銳[8]的方法測(cè)定醋醅中揮發(fā)性酸。

1.3.4 有機(jī)酸的測(cè)定

取50 g醋醅樣品置于150 mL超純水中浸泡3 h，過(guò)濾后取濾液10 mL移至50 mL容量瓶中，加入1 mL(106 g/L)亞鐵氰化鉀和1 mL(300 g/L)硫酸鋅去除濾液中的蛋白質(zhì)，定容，混勻，靜置30 min，取上清液，采用0.22 μm過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

取3 g醋醅樣品放入15 mL樣品瓶中，再加入1.5 g氯化鈉和6 mL超純水，蓋好樣品蓋后依次進(jìn)行預(yù)熱、恒溫和上機(jī)等步驟。

1.3.6 醋醅樣品中細(xì)菌DNA提取和測(cè)序

將醋醅樣品送至上海美吉公司進(jìn)行細(xì)菌DNA提取和MiSeq測(cè)序，對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V3～V4區(qū)(338F-806R)擴(kuò)增，引物序列分別是338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中總酸變化

酸是食醋具有代表性的感官特征，總酸包括揮發(fā)性酸和非揮發(fā)性酸，非揮發(fā)性酸中以乳酸為主，主要是調(diào)和食醋的刺激性氣味。四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化見(jiàn)圖1。

圖1 醋醅中總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間增加的變化

由圖1可知，四川麩醋的總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵第1天，醋醅中總酸含量為1.33 g/100 g，在發(fā)酵第21天，醋醅中總酸含量為5.08 g/100 g。在醋醅發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵環(huán)境中的乳酸菌和醋酸菌等產(chǎn)酸菌利用碳水化合物，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，如乳酸和醋酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致醋醅總酸上升。在發(fā)酵前5 d，醋醅的總酸含量快速上升，可能是由于發(fā)酵初期，醋醅環(huán)境中乳酸菌產(chǎn)酸導(dǎo)致醋醅中總酸上升。在發(fā)酵第5天～第9天，醋醅中的總酸含量增長(zhǎng)緩慢，可能是環(huán)境中乙醇抑制了醋醅中產(chǎn)酸菌的增長(zhǎng)，所以總酸的增長(zhǎng)減緩。在發(fā)酵第9天后，醋醅中總酸上升，此時(shí)是醋酸發(fā)酵過(guò)程，乙醇在醋酸菌作用下轉(zhuǎn)化為乙酸。

2.2 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性酸變化

乙酸是食醋中主要的揮發(fā)性酸，賦予食醋獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)。四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性酸含量的變化見(jiàn)圖2。

圖2 醋醅中揮發(fā)性酸含量隨發(fā)酵時(shí)間增加的變化

由圖2可知，四川麩醋的揮發(fā)性酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵第1天，醋醅中揮發(fā)性酸含量為0.05 g/100 g，在發(fā)酵第21天，醋醅中揮發(fā)性酸含量為2.71 g/100 g。在發(fā)酵第1天～第9天，醋醅中揮發(fā)性酸含量增長(zhǎng)緩慢，在發(fā)酵第9天，醋醅中揮發(fā)性酸含量為0.54 g/100 g，在發(fā)酵第9天后，醋醅中揮發(fā)性酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而快速增長(zhǎng)。醋醅發(fā)酵過(guò)程中，經(jīng)過(guò)“糖化、酒化、醋化”3個(gè)過(guò)程，醋化過(guò)程是乙酸生成的主要階段。

2.3 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸分析

四川麩醋醋醅中乳酸和乙酸在有機(jī)酸中的含量超過(guò)80%，揮發(fā)性有機(jī)酸中主要是乙酸，非揮發(fā)性有機(jī)酸中主要是乳酸，研究表明乙酸和乳酸的比值對(duì)食醋的品質(zhì)和感官有重要的影響，可見(jiàn)通過(guò)乙酸和乳酸的比值可比較不同時(shí)期食醋之間的差異[9]。四川麩醋醋醅中乙酸和乳酸的比值隨著發(fā)酵時(shí)間增加的變化見(jiàn)圖3。

圖3 醋醅中有機(jī)酸含量隨發(fā)酵時(shí)間增加的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，乙酸和乳酸的比值先減小后增大，在發(fā)酵第5天，乙酸和乳酸的比值達(dá)到最小值1.05。在發(fā)酵第17天，乙酸和乳酸的比值減小。在發(fā)酵第21天，乙酸和乳酸的比值達(dá)到最大值2.07。在麩醋陳釀期間，乙酸和乳酸的比值在2.00～3.02之間，此時(shí)的食醋具有柔和的清香[10]。

2.4 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的變化

四川麩醋中乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)和醋酸桿菌屬(Acetobacterspp.)的占比隨著發(fā)酵時(shí)間增加的變化見(jiàn)圖4。

圖4 醋醅中細(xì)菌占比隨發(fā)酵時(shí)間增加的變化

由圖4可知，在發(fā)酵第1天，醋醅中乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬的占比分別為49.01%和9.86%。在發(fā)酵初期，醋醅中主要以乳酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，在發(fā)酵第5天，乳酸桿菌屬的占比達(dá)到最大值65.86%。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，醋醅中乳酸桿菌屬的占比開(kāi)始下降，這是因?yàn)樵诰苹^(guò)程中，醋醅環(huán)境中會(huì)生成大量的乙醇，抑制了醋醅中乳酸桿菌屬的增長(zhǎng)。在發(fā)酵第21天，發(fā)酵環(huán)境中乳酸桿菌屬的占比為20.71%。而醋酸桿菌屬的占比隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸上升。在發(fā)酵第13天，醋酸桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬，在發(fā)酵環(huán)境中占比為41.53%。在發(fā)酵第21天，醋醅環(huán)境中醋酸桿菌屬的占比為65.63%。乳酸桿菌屬中主要為耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)和食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)，其中耐酸乳桿菌對(duì)乙醇有一定的耐受性，并且具有較強(qiáng)的產(chǎn)乳酸和乙酸的能力[11-12]；而食淀粉乳菌桿是人類(lèi)腸道中常見(jiàn)的益生菌，能產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸等物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)[13]。醋酸桿菌屬中主要為巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)，巴氏醋桿菌具有強(qiáng)耐乙醇特性，并且能將醋醅中的乙醇轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸等物質(zhì)[14]。

2.5 四川麩醋中風(fēng)味物質(zhì)分析

對(duì)麩醋醋醅中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 醋醅中風(fēng)味物質(zhì)

由表1可知，風(fēng)味物質(zhì)主要分為5類(lèi)，其中酯類(lèi)物質(zhì)有9種，主要有乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、2-羥基丙酸乙酯，研究發(fā)現(xiàn)食醋的香味物質(zhì)主要來(lái)源于酯類(lèi)，其中麩醋中含量最高的乙酸異戊酯具有水果的香氣，而乙酸苯乙酯具有玫瑰花和蜂蜜的香甜[15-16]。酸類(lèi)物質(zhì)主要有4種，其中主要是乙酸，含量達(dá)到43.56 mg/100 g，其次為異戊酸，含量為6.07 mg/100 g。醇類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)出6種，苯乙醇含量最高，為10.58 mg/100 g，食醋中的醇類(lèi)物質(zhì)多為酵母菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化而生成，因?yàn)楸揭掖季哂忻倒寤ǖ南闾穑苜x予食醋香味和甜味[17]。檢測(cè)出羰基類(lèi)物質(zhì)4種，乙偶姻的含量為2.75 mg/100 g，研究發(fā)現(xiàn)，乙偶姻有利于微生物的繁殖，能夠減少醋醅環(huán)境中乳酸等物質(zhì)，穩(wěn)定發(fā)酵環(huán)境的pH；此外，乙偶姻能賦予食醋奶香味[18]。

3 總結(jié)

四川麩醋是四川具有特色的調(diào)味品，研究四川麩醋醋醅發(fā)酵過(guò)程中的總酸、揮發(fā)性酸、有機(jī)酸、微生物和風(fēng)味物質(zhì)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四川麩醋醋醅總酸含量和揮發(fā)性酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵第21天時(shí)分別為5.08 mg/100 g和2.71 mg/100 g。乙酸和乳酸的比值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加先減小后增大，在發(fā)酵第5天時(shí)乙酸和乳酸的比值達(dá)到最低值1.05。醋醅中乳酸桿菌屬隨著發(fā)酵時(shí)間的增加先上升后下降，發(fā)酵第5天時(shí)乳酸桿菌屬的占比達(dá)到最大值65.86%；醋酸桿菌屬隨著時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵第21天時(shí)醋酸桿菌屬的占比達(dá)到最大值65.63%，醋醅中共檢測(cè)出風(fēng)味物質(zhì)24種。