發(fā)酵劑對(duì)鱘魚糜中生物胺的影響

才讓卓瑪，曾詩雨，張效平，李小義，劉霆，趙鳳*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，貴陽 550025；2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴陽 550025)

鱘魚為鱘形目魚類的總稱，是現(xiàn)存起源最早的脊椎動(dòng)物之一，生長(zhǎng)快、病害少，因肉質(zhì)鮮美，無肌間刺，具有抗癌、美容養(yǎng)顏的作用，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。2019年全國鱘魚養(yǎng)殖量為102042 噸，其中，貴州的養(yǎng)殖量達(dá)14101 噸[1]。目前貴州省內(nèi)的鱘魚多以鮮銷為主，經(jīng)濟(jì)附加值較低。

發(fā)酵作為一種用于貯藏食品并增強(qiáng)食品風(fēng)味的加工技術(shù)，可以提高食品的風(fēng)味與營養(yǎng)品質(zhì)[2]。發(fā)酵食品是讓益生菌進(jìn)入體內(nèi)的良好方式[3]，但與此同時(shí)，發(fā)酵制得的食品會(huì)產(chǎn)生包括生物胺在內(nèi)的有毒物質(zhì)[4]，為食用者帶來健康隱患，其中，富含生物胺的發(fā)酵肉制品以發(fā)酵香腸和水產(chǎn)品為主[5]。生物胺(biogenic amines，BAs)是一種低分子量、有生物活性的含氮化合物的總稱[6]。微量生物胺對(duì)機(jī)體無害，但是當(dāng)過量攝入時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列的不良反應(yīng)，如發(fā)燒、過敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性[7-9]。因此，控制食品中的生物胺含量可有效提高食品的安全性。有研究表明，將對(duì)人體無害的有益菌種接種到魚體中能抑制生物胺的合成[10-12]；植物乳桿菌可提高發(fā)酵食品的風(fēng)味和安全性[13-14]。但是單一菌種發(fā)酵過程中會(huì)出現(xiàn)生物胺累積的風(fēng)險(xiǎn)，而復(fù)配發(fā)酵劑可彌補(bǔ)該缺陷，使各菌種發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)[15]。

魚糜制品是將魚肉絞碎后加鹽擂潰、調(diào)味，進(jìn)行水煮、油炸等處理而制得，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源[16]，且擁有廣闊的市場(chǎng)前景[17]。利用發(fā)酵工藝制得的魚糜制品可賦予產(chǎn)品良好的品質(zhì)和保健功能，目前市場(chǎng)上發(fā)酵鱘魚糜制品較少。本研究以雜交鱘魚為原料，探討鱘魚糜在發(fā)酵過程中生物胺含量的變化情況，為鱘魚的精深加工提供理論參考，并在一定程度上推動(dòng)鱘魚加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雜交鱘魚：貴州省水產(chǎn)研究所惠水基地；食鹽、玉米淀粉、胡椒粉、白砂糖、料酒、蔥姜粉：食品級(jí)，采購于貴陽市合力超市花溪店。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)：廣東省微生物菌種保藏中心；MRS培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；組胺、精胺、亞精胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、色胺、酪胺(均為色譜級(jí))：美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、丙酮、乙腈(均為色譜級(jí))：美國Fisher 公司；丹磺酰氯(純度97%)、三氯乙酸(純度99%)：上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；氨水(分析純)、甲酸銨(LC-MS級(jí))：上海阿拉丁試劑有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉(均為分析純)：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20a高效液相色譜儀 日本島津公司；T-25勻漿機(jī) 德國IKA公司；LDZF-50L立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F垂直流潔凈工作臺(tái) 吳江市偉峰凈化設(shè)備有限公司；WPL-125電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Milli-Q IQ7000純水儀 德國密理博公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

無菌條件下，分別吸取0.3 mL的無菌水，滴入植物乳桿菌和戊糖片球菌凍干管中，輕輕振蕩至溶解，吸取全部菌懸液，分別接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃純化培養(yǎng)，得實(shí)驗(yàn)用發(fā)酵菌株。用麥?zhǔn)媳葷岱▽l(fā)酵菌株用無菌生理鹽水稀釋成108CFU/mL的菌懸液，即得發(fā)酵劑。

1.3.2 樣品的制備及處理

冷凍鱘魚肉于4 ℃解凍，漂洗2次，瀝干水分，用絞肉機(jī)絞成魚肉糜，以魚糜總量百分比計(jì)，加入2%食鹽、8%玉米淀粉、2%白砂糖及適量香辛料(料酒、胡椒等)、1%發(fā)酵劑(植物乳桿菌∶戊糖片球菌為1∶1)，攪拌均勻，真空包裝，未接種發(fā)酵劑組作為對(duì)照組。26 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵0，12，24，36，48，60 h時(shí)測(cè)定生物胺含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺 8種標(biāo)準(zhǔn)品各5.1，13.9，3.1，8.3，2.1，1.7，3.5，1.3 mg，然后用0.1 mol/L的鹽酸分別定容到10 mL，并分別稀釋為510，1390，310，830，210，170，350，130 μg/mL的母液，分別稀釋100，80，50，25，20，10倍，配制成混標(biāo)溶液。

1.3.4 生物胺的柱前衍生

取1 mL混標(biāo)液，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH 溶液、300 μL飽和NaHCO3緩沖溶液、丹磺酰氯2 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中，40 ℃避光反應(yīng)45 min，加入100 μL 25%的氨水于暗處靜置30 min，終止衍生反應(yīng)后用乙腈定容至5 mL，用0.22 μm濾膜過濾備用。

1.3.5 樣品衍生化

取5 g樣品，加入15 mL 5%三氯乙酸溶液，均質(zhì)，于4 ℃以10000 r/min 離心10 min，取上清液，加入10 mL 三氯乙酸溶液重復(fù)1次，合并上清液，定容至50 mL。將其過濾后取濾液10 mL，加入1/2倍體積的正己烷萃取除脂，分層后去除有機(jī)相，重復(fù)處理2次。取1 mL除脂后的生物胺提取液依次加入200 μL 2 mol/L的氫氧化鈉、300 μL的飽和碳酸氫鈉溶液及1 mL的丹磺酰氯溶液，混合均勻后于40 ℃避光反應(yīng)45 min，加入100 μL 25%氨水避光保存30 min，終止反應(yīng)后用乙腈定容到5 mL，以3000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 生物胺的測(cè)定

InsertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm，日本島津公司)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸銨，流動(dòng)相B：乙腈，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量50 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以生物胺濃度和峰面積為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8種生物胺的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

由表2可知，8種生物胺的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995，表明這8種生物胺的質(zhì)量濃度和峰面積之間線性關(guān)系良好。

2.2 發(fā)酵過程中鱘魚糜生物胺含量的變化

生物胺的含量與水產(chǎn)品的品質(zhì)密切相關(guān)，當(dāng)腐敗微生物使水產(chǎn)品中的游離氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)時(shí)，會(huì)生成大量生物胺，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量[18]。檢測(cè)鱘魚糜在26 ℃下從0 h發(fā)酵至60 h的過程中發(fā)酵組和對(duì)照組中生物胺含量的變化情況，結(jié)果見圖1。

a.發(fā)酵過程中色胺含量的變化

由圖1中a 可知，發(fā)酵初期，色胺含量為0.117 mg/kg，發(fā)酵至60 h時(shí)，對(duì)照組和發(fā)酵組的色胺含量分別為0.410 mg/kg和0.261 mg/kg，發(fā)酵組的色胺含量低于對(duì)照組，這一結(jié)果可能是所用的發(fā)酵劑抑制了色胺的積累[19]。韋宗卉[20]也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，辣椒醬中色胺和腐胺的含量有所降低。

苯乙胺作為一種芳香族生物胺，可被單胺酶氧化分解。當(dāng)人體攝入過量苯乙胺時(shí)，會(huì)出現(xiàn)失眠、頭痛等不良反應(yīng)[21]。由圖1中b可知，發(fā)酵初期，對(duì)照組和發(fā)酵組均未檢出苯乙胺。當(dāng)發(fā)酵至48 h時(shí)，對(duì)照組中檢測(cè)到少量苯乙胺；發(fā)酵至60 h時(shí)，對(duì)照組中的苯乙胺含量由0.073 mg/kg增加至0.494 mg/kg。發(fā)酵組中，當(dāng)發(fā)酵至60 h時(shí)，苯乙胺含量?jī)H為0.035 mg/kg。因此對(duì)于短期的鱘魚糜發(fā)酵，苯乙胺或不適合作為評(píng)價(jià)其腐敗變質(zhì)的指標(biāo)。

腐胺由鳥氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)形成，普遍存在于水產(chǎn)類食品中[22]，其能直接參與生物體的部分生理活動(dòng)，攝入過量會(huì)引起頭痛等癥狀[23]。由圖1中c可知，發(fā)酵初期腐胺的含量為0.708 mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。發(fā)酵至48 h后，對(duì)照組和發(fā)酵組中的腐胺含量均有所降低，其原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，部分腐胺作為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了亞精胺和精胺[24]。

尸胺和腐胺類似，對(duì)人體沒有直接的健康威脅，而是通過抑制組胺代謝酶如單胺或二胺氧化酶和組胺甲基轉(zhuǎn)移酶的活性來增強(qiáng)組胺和酪胺的毒性效應(yīng)[25]，它們能夠與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生產(chǎn)致癌物亞硝基胺，因此仍需關(guān)注這兩種生物胺在鱘魚糜發(fā)酵過程中含量的變化情況。由圖1中d可知，發(fā)酵初期，尸胺的含量為0.266 mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和發(fā)酵組的尸胺含量均有所增加。發(fā)酵至60 h時(shí)，對(duì)照組和發(fā)酵組的尸胺含量分別為24.150 mg/kg和18.627 mg/kg，發(fā)酵組較對(duì)照組含量有所下降。Simion等[26]以植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)最終香腸中腐胺和尸胺含量下降。本研究也得到類似規(guī)律，當(dāng)發(fā)酵至60 h時(shí)，發(fā)酵組中的腐胺和尸胺含量較對(duì)照組均有所下降，與前人的研究結(jié)果相似。

酪胺的毒性被認(rèn)為僅次于組胺[27]，酪胺引起的食源性胺中毒常被稱為“奶酪反應(yīng)”，歐盟規(guī)定酪胺在食品中的限量為 100 mg/kg[28]。由圖1中g(shù)可知，發(fā)酵至60 h時(shí)，對(duì)照組和發(fā)酵組的酪胺含量分別為5.144 mg/kg和4.264 mg/kg，發(fā)酵組的酪胺含量較對(duì)照組低，該結(jié)果可能是發(fā)酵劑中的植物乳桿菌對(duì)鱘魚糜產(chǎn)生的酪胺進(jìn)行了一定程度的降解所致，與前人研究的從火腿中分離出的植物乳桿菌和干酪乳桿菌可以不同程度地降解酪胺結(jié)果相似[29]。

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)照組和發(fā)酵組的亞精胺含量和精胺含量并未呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性(見圖1中e和f)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是亞精胺和精胺這兩種生物胺本身的性質(zhì)不穩(wěn)定易分解所致[30]。

組胺是水產(chǎn)品發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的生物胺中對(duì)人類健康影響最大的一種[31]。青皮紅肉類魚等鯖科魚類因富含組氨酸從而易產(chǎn)生組胺，因此組胺中毒又稱鯖科魚類中毒。 GB 2733-2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》規(guī)定，鮐魚、鲹魚、金槍魚及沙丁魚等青皮紅肉海水魚組胺含量不得超過 400 mg/kg，而其他海水魚類組胺含量不得超過 200 mg/kg。FDA規(guī)定進(jìn)口水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50 mg/kg[32]，EFSA規(guī)定水產(chǎn)品和食品中組胺含量不得高于100 mg/kg[33]。田甜等[34]研究發(fā)現(xiàn)，接種戊糖片球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、漢遜德巴利酵母、清酒乳桿菌5種微生物制備成的復(fù)合發(fā)酵劑的廣味香腸的組胺含量較自然發(fā)酵的降低了10.14%，提高了香腸的食用安全性。本研究中發(fā)酵60 h時(shí)，發(fā)酵組和對(duì)照組中的組胺含量分別為0.521 mg/kg和0.680 mg/kg，發(fā)酵組較對(duì)照組的組胺含量低23.38%，與前人的研究結(jié)果類似。

3 結(jié)論

水產(chǎn)品中的生物胺在存儲(chǔ)過程中，過高的溫度和較差的生產(chǎn)條件都會(huì)增加水產(chǎn)品中生物胺的積累。Chong等[35]研究發(fā)現(xiàn)，印度鲅魚在25～29 ℃貯藏過程中，除亞精胺和精胺外，其他生物胺的含量均顯著增加。本研究也得出類似規(guī)律，色胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、組胺這5種生物胺隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其含量均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。

本研究中，發(fā)酵初期，除精胺與亞精胺之外的6種生物胺含量均較低，說明原料鱘魚較新鮮。同時(shí)，在發(fā)酵過程中，各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵組中的生物胺含量均低于對(duì)照組，說明復(fù)合發(fā)酵劑對(duì)鱘魚糜中生物胺的生成有一定抑制作用，其原因可能是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制了其他有害微生物的生長(zhǎng)。翟鈺佳等[36]以植物乳桿菌為發(fā)酵劑，發(fā)現(xiàn)羊肉發(fā)酵香腸中生物胺的形成被顯著抑制。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)分離自食物的植物乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌等菌株可在體外降解酪胺和組胺[37]，這與本研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵劑有助于抑制鱘魚糜中生物胺的產(chǎn)生，提高食用安全性，為工業(yè)化安全生產(chǎn)發(fā)酵鱘魚制品提供了一定的數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為發(fā)酵技術(shù)在鱘魚加工中的應(yīng)用提供了一定參考。