響應面法優化大蒜素提取工藝

趙婷，付君沐，尹懷寧，方尚玲，李小強*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.湖北將軍紅健康產業股份有限公司，湖北 麻城 438399)

大蒜是百合科多年生草本植物的鱗莖[1-2]，富含功能性成分及營養價值[3]，被作為一種藥食兩用的植株[4]。大蒜在日常生活中通常被用于調味料，因其含有鉀、鈣、磷等微量元素以及多種人體必需氨基酸，被人們稱為“天然抗生素”[5]，已普遍在食品、藥品、養生等方面使用[6-7]。大蒜素是一種天然的活性物質[8]，其具有抑菌、防氧化、減少膽固醇等功能[9-10]，可以作為制作安全有益產品的最佳添加劑，代替抗生素；其次是用于腫瘤治療的一種藥物[11-14]。相關研究表明，新鮮的大蒜中并不直接含有大蒜素，而是含有蒜氨酸。蒜氨酸是一種在大蒜中并不穩定存在的大蒜素的前體物質[15-16]，其在大蒜細胞破裂時被釋放并活化，催化蒜氨酸形成大蒜素。

綜合國內外關于大蒜素提取的方法主要有3種：有機溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法。其中，有機溶劑提取法具有成本低、設備簡單、操作簡便、提取率高等特點，作為人們常用的提取方法，被用于食品、藥品等領域[17]。水蒸氣蒸餾法，雖然設備簡易且使用方便，但在高溫的蒸餾條件下會導致蒜氨酸酶失活，大蒜素提取效率較低。超臨界CO2萃取法，具有高提取率、高質量的特點，但工藝成本高，不易作為制備高附加值食品的方法大規模投入工業化生產[18]。用于衡量大蒜及其加工產品質量的重要指標是大蒜素的含量。目前以大蒜為原料制作的深加工產品有很多，其中大蒜酒是利用酒精浸提半發酵法釀造的，其特點是無大蒜異臭味，能保持大蒜的清香，有抑菌的作用[19-20]。綜合考慮，本實驗采用乙醇作為有機溶劑提取大蒜素，可為后續開發大蒜酒、大蒜醋及大蒜膏等高附加值產品作準備。

續 表

從大蒜中提取大蒜素，需先破碎大蒜，經自然酶解，釋放蒜氨酸酶并催化形成大蒜素。大蒜素的性質不穩定，易揮發，因此在提取工藝中料液比、酶解條件、提取時間等因素都會影響大蒜素的提取率[21]。利用大蒜素可與半胱氨酸反應的原理，通過DTNB法測定半胱氨酸前后的減少量，間接得出大蒜素的含量。在3種干、濕大蒜中選取大蒜素含量最高的一種大蒜為原料，通過對大蒜素提取率有影響的5個因素進行單因素實驗，選取3個影響較大的因素結合響應面優化大蒜素的提取工藝條件，以確定最佳工藝。本研究為大蒜深加工產品的開發和大蒜素的工業化生產提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

干、濕蒜(河北永年、山東金鄉和四川彭州)：市售；食用酒精(95%)：武漢某酒廠提供。

1.2 試劑

半胱氨酸(C3H7NO2S)、Tris試劑：廣州賽國生物科技有限公司；DTNB(5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))：美國Sigma公司。

1.3 主要儀器與設備

AR3130電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫搖床 上海智誠實驗設備有限公司；5424R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 浙江金壇市富華儀器有限公司；UV-2102型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 大蒜素的提取

將大蒜去表皮洗凈，搗成泥狀。取20 g蒜泥在一定溫度下自然酶解一段時間，加入一定體積、濃度的乙醇溶液，放置于恒溫搖床40 ℃、150 r/min振蕩浸提蒜泥2 h，離心分離后取上清液，備用。

大蒜→去皮→搗碎→自然酶解→乙醇浸提→離心→上清液。

1.4.2 大蒜素的測定

根據DTNB法測定半胱氨酸含量原理[22]：

A0：0.5 mL V1+1 mL V2+3.5 mL V3→26 ℃保溫15 min→于412 nm處測定吸光值。

A：0.5 mL V1+0.5 mL V4→26 ℃保溫15 min→1 mL V2+3.0 mL V3→26 ℃保溫15 min→于412 nm處測定吸光值。

其中，V1為半胱氨酸溶液(1.0 mmol/L)；V2為DTNB溶液(1.0 mmol/L)；V3為Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.5)；V4為適量稀釋的待測液。

根據半胱氨酸減少量計算出大蒜素含量，計算公式如下：

式中：△A412=A0-A；d為總稀釋倍數；14150為NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸)在412 nm，1 cm光徑摩爾消光系數。

1.4.3 不同品種大蒜的大蒜素測定

采用河北永年(濕蒜和干蒜)、山東金鄉(濕蒜和干蒜)和四川彭州(干蒜)的大蒜為原料，測定其中大蒜素的含量，選取實驗最佳品種。

1.4.4 單因素實驗

分別確定料液比、酶解溫度、酶解時間、乙醇濃度和浸提時間這5個單因素對大蒜素提取的影響，見表1。設計五因素五水平的單因素實驗，測其大蒜素含量[23-24]。每組實驗重復3次，取平均值。

表1 大蒜素提取工藝單因素實驗

1.4.5 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，選取對大蒜素提取效果影響顯著的3個因素為自變量，以大蒜素為響應值(Y)進行響應面優化實驗。利用Design Expert 8.0.6軟件設計Box Behnken實驗，確定最優的提取條件并進行實驗驗證[25]。

1.4.6 數據處理

采用GraphPad Prism 8.2.1軟件對數據進行處理和作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種大蒜的大蒜素測定

由表2可知，比較3個不同品種的干、濕蒜的大蒜素含量，發現彭州干蒜的大蒜素含量最高，達到0.138 mmol/100 g。

表2 不同品種干、濕蒜的大蒜素含量

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比對大蒜素提取的影響

料液比對大蒜素含量的影響見圖1。

圖1 料液比對大蒜素含量的影響

由圖1可知，大蒜素含量隨著料液比從1∶4～1∶6的增加而上升，當料液比為1∶6后大蒜素含量開始下降。原因是乙醇用量越多，大蒜素提取率越高，當料液比增加至一定比例時，大蒜素基本溶出，料液比再增加大蒜素含量有所降低可能是因為大蒜素是不穩定的硫化物，會有副產物溶出。所以，料液比在1∶6后大蒜素含量下降。因此，選擇最佳料液比為1∶6。

2.2.2 乙醇濃度對大蒜素提取的影響

乙醇濃度對大蒜素含量的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對大蒜素含量的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，大蒜素含量緩慢上升，當乙醇濃度為85%時，大蒜素含量最高，為0.172 mmol/100 g。隨后大蒜素含量下降，可能是因為乙醇濃度過高會導致蒜氨酸酶失活，生成的大蒜素減少。因此，選擇最佳乙醇濃度為85%。

2.2.3 酶解溫度對大蒜素提取的影響

酶解溫度對大蒜素含量的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對大蒜素含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，大蒜素的含量呈現先增加后減少的變化趨勢。大蒜素的提取含量在35 ℃酶解時最高，可達到0.160 mmol/100 g。蒜氨酸酶在低溫條件下酶活性較低，催化大蒜素的形成不完全；但大蒜素在較高的溫度下不穩定，易分解。因此，最佳的酶解溫度為35 ℃。

2.2.4 酶解時間對大蒜素提取的影響

酶解時間對大蒜素含量的影響見圖4。

圖4 酶解時間對大蒜素含量的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，大蒜素的提取含量先增加，酶解30 min時大蒜素含量為0.162 mmol/100 g，達到最高，隨后呈現減少的趨勢。蒜氨酸在較短時間內并不能夠充分轉換成大蒜素，提取含量低。酶解時間過長，大蒜素不再生成，且大蒜素易揮發，整體含量下降。因此，選擇最佳酶解時間為30 min。

2.2.5 浸提時間對大蒜素提取的影響

浸提時間對大蒜素含量的影響見圖5。

圖5 浸提時間對大蒜素含量的影響

由圖5可知，隨著浸提時間的延長，大蒜素的含量呈先增加后逐漸減少的趨勢。大蒜素的含量在浸提時間為2 h時最高，為0.164 mmol/100 g。分析可能是前期浸提時間較短對大蒜素向乙醇相的轉移有影響；而浸提時間過長時，已生成的大蒜素因其不穩定會揮發或分解成其他物質。因此，選擇最佳浸提時間為2 h。

2.3 響應面優化實驗結果

2.3.1 Box-Behnken設計與結果

在單因素實驗結果的基礎上，確定料液比(A)、浸提時間(B)、乙醇濃度(C)對大蒜素提取影響較大的3個因素為自變量，以大蒜素的含量(Y)為因變量。根據Box-Behnken設計的實驗因素與水平見表3；響應面分析設計17個實驗點，實驗設計與結果見表4。

表3 Box-Behnken實驗因素與水平

表4 Box-Behnken實驗設計與結果

2.3.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6軟件對表4的實驗結果進行多元二次回歸擬合，回歸方程的方差分析結果見表5。

表5 響應面回歸方程的方差分析

由表5可知，回歸模型的F值為93.82，且顯著性檢驗(P<0.0001)為極顯著，失擬項(P=0.6781>0.05)為不顯著，說明該模型具有可靠性。

利用響應面分析軟件對表5中的數據進行回歸擬合，得到大蒜素含量對自變量料液比、乙醇濃度、浸提時間的多元回歸方程為：大蒜素=0.16+1.250E-004A-1.750E-003B+2.625E-003C+1.000E-003AB-4.250E-003AC+0.000BC-0.016A2-7.425E-003B2-3.175E-003C2，回歸方程決定系數R2=99.18%，RAdj2=98.12%，表明該模型的預測值與實際值之間存在良好的可信度和擬合度，該方案結果可靠。

2.3.3 各因素響應面交互作用分析

利用響應面分析軟件對二次響應面回歸模型作出對應的響應曲面圖，見圖6。

a

由響應曲面圖可以清楚地看出各因素之間存在交互作用。由圖6可知，AB、BC和AC兩者間均有顯著的交互作用，因此響應面曲線的分析結果是準確的。

2.4 最佳提取條件的確定及驗證

從上述回歸模型中求得大蒜素的最佳提取條件：料液比為1∶5.94，浸提時間為1.88 h，乙醇濃度為87.28%。此條件下，模型預測值大蒜素含量為0.163 mmol/100 g。考慮到實際情況，調整條件為料液比1∶6、浸提時間2 h、乙醇濃度87%進行驗證實驗。結果表明，在最佳提取條件下大蒜素含量達到0.162 mmol/100 g，與預測值基本接近，說明所建模型擬合良好且可靠。

3 結論

本文以四川彭州大蒜為原料，選擇乙醇有機溶劑提取大蒜素的工藝條件。通過料液比、酶解溫度、酶解時間、乙醇濃度、浸提時間5個提取條件進行單因素實驗，利用響應面實驗對影響較大的3個因素進行優化，確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶5.94、浸提時間1.88 h、乙醇濃度87.28%。考慮實際情況調整為料液比1∶6、浸提時間2 h、乙醇濃度87%，在此條件下進行驗證，模型預測值大蒜素含量為0.162 mmol/100 g，比前期報道的提取大蒜素效果較好。該研究對大蒜素提取條件進行初探，后續可進行濃縮用于開發大蒜酒、大蒜醋、大蒜浸膏等功能性食品，為大蒜深加工產品的開發和大蒜素工業化的生產提供了一定的理論依據。