響應面法優化常壓蒸餾提取迷迭香精油工藝

嚴文芳，高新華，楊銳銑，趙興文，羅紅偉，李正祥，楊海英

(1.大理農林職業技術學院 工程學院,云南 大理 671003；2.云南民族大學化學與環境學院，昆明 650500)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)屬唇形科迷迭香屬多年生灌木植物，葉片氣味芳香，清新宜人，具有桉葉油素和樟腦余韻，略帶苦味，原產于地中海地區，是一種傳統的藥食同源植物[1]。云南香料植物種類較多，其中迷迭香生長良好。從迷迭香葉片中提取的揮發性物質迷迭香精油用途廣泛，具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗抑郁、預防皮膚疾病等作用[2-6]，迷迭香提取物對鱸魚調味去腥效果明顯[7]。近年來，迷迭香精油作為一種天然活性物質，由于具有良好的抑菌性和抗氧化活性在食品添加、食品保鮮、醫藥保健、化妝品行業中應用越來越多[8-10]。

目前國內迷迭香精油提取方法常用的有微波輔助水蒸氣蒸餾法、超聲輔助水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、酶法輔助提取法等[11-14]，上述方法多為從干燥后葉片中提取精油，目前“種植基地+工廠”的生產模式已經可以很好地支持直接從新鮮迷迭香葉片中提取精油的加工方式，陳亮等[15]的研究中提出新鮮迷迭香葉片提取的精油中所含成分多于干燥后的迷迭香葉片。在此研究背景下，課題組選用大理本地生長的馬鞭草酮迷迭香品種，以新鮮嫩枝條作為實驗原料，每次用枝剪剪取約25 cm長短的鮮葉20 kg用于蒸餾提取精油，進行工藝優化實驗。本研究采用常壓蒸餾法從新鮮葉片中提取精油，通過測定鮮葉的水分含量，控制蒸餾速度，分液時在餾液中添加固體NaCl改善分液效果，控制預加熱時間等可能影響精油出油率的工藝條件，得到基礎數據后采用響應面法優化，進而得出常壓蒸餾法提取迷迭香精油的最佳工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料

新鮮迷迭香嫩枝：大理本地生長的馬鞭草酮迷迭香品種，2～3年生苗木，開紫色小花，課題組根據實驗需要采摘嫩枝條用于研究。

1.2 試劑

氯化鈉(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；AR2202CN電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司；PHS-2F型酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司；阿貝折光計 上海精密儀器儀表有限公司；X300恒溫平臺 深圳市鑫豪邁電子科技有限公司；ZNHW數顯電熱套 上海力辰邦西儀器科技有限公司；DHS-10A水分測定儀 上海儀昕科學儀器有限公司；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 加熱儀器選擇

課題組分別采用恒溫平臺和加熱套進行迷迭香精油蒸餾提取實驗，通過對比實驗，發現采用加熱套蒸餾不利于觀察，會造成物料焦糊，不易清潔；采用恒溫平臺的優點是利于觀察，方便調溫控制蒸餾速度，故選恒溫平臺作為加熱儀器。

1.4.2 加熱容器選擇

課題組分別采用圓底燒瓶和三角燒瓶進行迷迭香精油蒸餾提取實驗，通過對比，圓底燒瓶由于燒瓶口小，裝填物料耗時長，蒸餾結束取出殘渣困難；三角燒瓶利于裝填物料和取出蒸餾殘渣，節約時間。故選三角燒瓶作為加熱儀器。

1.4.3 蒸餾提取工藝條件選擇[16-21]

稱取混勻的1 kg迷迭香嫩枝條剪成約2 cm長，料液比(迷迭香∶純水)為1∶1，并測定采摘的迷迭香嫩枝條在第1,3,7天的水分。

1.4.3.1 控制蒸餾速度實驗

同一水分的迷迭香嫩枝，課題組從蒸餾速度的因素出發，分別控制蒸餾速度為1，2，3 滴/s，蒸餾時間為5.0，3.0，2.0 h，蒸餾結束后用1000 mL分液漏斗進行分液，所得上層液體為迷迭香精油，淡黃色，有特有的馬鞭草酮迷迭香精油的香氣，稱量提取所得精油質量(g)，計算精油提取率(%)和精油提取率(以干物質計，%)，測定下層溶液迷迭香純露pH，純露pH為4.60～4.61，測定精油折光率為1.4706，實驗數據見表1。

表1 控制蒸餾速度提取迷迭香精油實驗數據

由表1可知，迷迭香嫩枝條水分從第1天到第3天下降了9.92 g/100 g，以第3天到第7天水分下降了2.09 g/100 g。實驗中蒸餾速度控制為1 滴/s時，精油提取率為1.14%～1.61%，精油提取率(以干物質計)為4.29%～4.63%；蒸餾速度控制為2 滴/s時，精油提取率為1.16%～1.61%，精油提取率(以干物質計)為4.29%～4.65%；蒸餾速度控制為3滴/s時，精油提取率為1.01%～1.41%，精油提取率(以干物質計)為3.82%～4.08%。從精油提取率的高低可以看出，控制蒸餾速度為2 滴/s和1 滴/s時，精油提取率相對較高，用時分別為3 h和5 h。

1.4.3.2 萃取分液時添加NaCl實驗

迷迭香精油分離提取時，課題組使用分液漏斗靜置分層，精油和純露分層不明顯，影響分液。為更好地進行油水分離提高精油提取率，課題組重新采樣，測定迷迭香嫩枝在第1天水分為75.22%，1 kg新鮮迷迭香葉片中加入1 L純水(料液比為1∶1)，控制蒸餾速度為2滴/s，蒸餾3組，蒸餾結束時，餾液體積約為500 mL，在分液漏斗中分別加入2.5，5.0，7.5 g固體NaCl，觀察記錄分液漏斗靜置時的現象，記錄所提取精油和純露的體積(mL)，稱量提取精油的質量(g)，計算精油提取率(%)，測定分離后下層溶液迷迭香純露pH值，純露pH為4.60～4.61，加入氯化鈉前、后pH值無變化，測定20 ℃時精油折光率為1.4707，20 ℃時精油密度為0.8947，實驗數據見表2。

表2 精油提取時添加固體NaCl實驗數據

由表2可知，在精油提取靜置分層時每500 mL餾液中加入2.5 g固體NaCl(添加量為0.5 g/dL)時，分層較不添加明顯；當加入5.0 g固體NaCl(添加量為1.0 g/dL)時，分層明顯；當加入7.5 g固體NaCl(添加量為1.5 g/dL)時，分層明顯。在餾液中添加固體NaCl，可以提高精油提取率。當添加量為0.5 g/dL時，精油提取率相對提高3.03%；添加量為1.0 g/dL時和添加量為1.5 g/dL時，精油提取率相對提高了4.24%和4.33%。從實驗數據得出餾液中固體NaCl添加量為1.0 g/dL可達到分層明顯的效果。

1.4.3.3 預加熱實驗

考慮到迷迭香精油成分復雜且含多種有效化合物成分[22]，由于各組分沸點不同，課題組重新采樣，測定迷迭香嫩枝在第1天水分為75.20%，1 kg迷迭香鮮葉加入1 L純水(料液比為1∶1)，在蒸餾時加熱至沸騰后保持微沸狀態，時間分別為20，30，40 min后繼續蒸餾，控制蒸餾速度為2 滴/s， 蒸餾結束后加入5.0 g固體NaCl，靜置分層30 min，萃取分液。量取精油體積(mL)，稱量精油質量(g)，計算精油提取率(%)，計算精油密度，測定精油折光率，測定下層液體迷迭香純露pH，純露pH為4.60～4.61，20 ℃時精油折光率為1.4706，20 ℃時精油密度為0.8946，實驗數據見表3。

表3 精油提取時預加熱實驗數據

由表3可知，預加熱20 min時迷迭香精油提取率相對提高了9.92%，預加熱30 min和40 min時，精油提取率相對提高了11.57%，常壓蒸餾時進行預加熱30 min可以使精油提取率相對提高10%以上。

1.4.4 響應面優化實驗

根據迷迭香精油常壓蒸餾提取工藝條件選擇實驗結果，選擇剛采摘1 d的迷迭香嫩枝，水分含量在75.17%～75.22%，選取了蒸餾速度、NaCl添加量和預加熱時間3個可能對精油提取率影響較大的因素，設計Box-Behnken實驗，響應面實驗因素和水平見表4。

表4 響應面實驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 響應面實驗設計[23-27]

應用Design Expert軟件進行響應面實驗設計，見表5。

表5 響應面實驗設計

對響應面實驗設計進行軟件分析擬合，得到殘差診斷圖、模型統計方差分析表和模型等高線、響應面圖。

2.2 殘差診斷圖和模型統計方差分析

2.2.1 殘差正態概率圖和殘差與運行順序圖

由分析軟件Diagnostics菜單得到正常的殘差正態概率圖和殘差與運行順序圖，見圖1。

圖1 殘差正態概率圖和殘差與運行順序圖

由圖1可知，17個實驗點的標準化殘差均落在(-2，2)區間，在95%置信度為正常的實驗點，均參與回歸直線擬合。從殘差與運行圖中17個實驗點的分布趨勢判斷，實驗設計呈近似正態分布，所擬合的線性模型滿足相關假設，模型設計正確[28]。

2.2.2 響應面實驗回歸模型方差分析

使用軟件進行響應面回歸模型的方差分析，得到精油提取率方差分析表，見表6。

表6 回歸模型方差分析

由表6可知，回歸模型的P<0.0001，極顯著，而失擬項的P=0.2813>0.05，不顯著。此外，模型的F值為113.44，表明該模型是顯著的，該模型擬合程度良好，可用來分析響應值與因素值的關系及變化情況。由表6中F值的大小可知，3個實驗因素對迷迭香精油提取率的影響大小排序是A(蒸餾速度)>C(預加熱時間)>B(NaCl添加量)。

P值<0.0500表明模型項是顯著的。由表6可知，A、B、C、A2、B2、C2是重要的模型項；而AB、AC、BC對精油不顯著(P>0.05)。

2.2.3 二次回歸方程分析

對表5中實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得精油提取率對中蒸餾速度(A)、NaCl添加量(B)、預加熱時間(C)的多元回歸方程為：精油提取率=0.98+0.2025A+0.1125B+0.011125C-0.01AB-5.0E-004AC+5.0E-004BC-0.06375A2-0.045B2-1.625E-004C2。

模型的二項式擬合相關系數R2=0.9932，表明該模型擬合程度良好。模型的修正相關系數RAdj2=0.9844，說明預測值和實測值基本吻合，預測性良好[29-31]。

2.2.4 等高線和響應面分析

蒸餾速度與NaCl添加量、蒸餾速度與預加熱時間、NaCl添加量與預加熱時間這3組因素間有交互作用，對其進行響應面分析，探究它們之間的具體交互規律。回歸模型獲得的等高線圖和響應曲面圖見圖2～圖4。

圖2 蒸餾速度和NaCl添加量對精油提取率影響的等高線和響應面

圖3 蒸餾速度和預加熱時間對精油提取率影響的等高線和響應面

圖4 NaCl添加量和預加熱時間對精油提取率影響的等高線和響應面

由圖2～圖4可知，等高線呈橢圓形，3個響應因素在相對應的實驗范圍內都有響應極值，且3組因素的交互作用結果與方差分析結果一致。通過對各響應因素交互作用對精油提取率影響的響應面及等高線圖進行分析，并結合軟件計算回歸模型可以預測出迷迭香精油的最佳提取工藝條件為蒸餾速度2 滴/s，預加熱時間30 min，蒸餾液以1.0 g/dL添加固體NaCl，將三因素代入回歸方程計算得出精油提取率為1.35%，當新鮮嫩枝水分為75.20%時，精油提取率(以干物質計)可達5.44%。

2.3 最佳工藝條件實驗驗證

為驗證回歸模型的預測值與實驗真實值之間的擬合程度，采用精油提取率最大值對響應因素進行驗證。選定蒸餾速度2 滴/s，預加熱時間30 min，蒸餾液以1.0 g/dL添加固體NaCl，其他條件不變，進行3組平行實驗，測定迷迭香嫩枝水分為75.22%，精油平均提取率為1.347%，精油提取率(以干物質計)可達5.44%。此實驗值與回歸模型精油提取率預測值(1.35%)相對誤差為0.22%。因此，通過響應面法優化得到的常壓蒸餾提取精油最佳工藝條件的回歸模型是符合實際的，對今后常壓蒸餾迷迭香提取精油工藝參數選擇具有一定指導意義。

3 結論

實驗數據和分析結果表明，通過響應面法優化后的常壓蒸餾法提取迷迭香精油的工藝較穩定，方法簡便易掌握，成本低而提取率較優化前有顯著提高。常壓蒸餾法提取的迷迭香精油無溶劑殘留等污染，精油純度高，折光率為1.4706～1.4707，密度為0.8946～0.8947，化學成分種類多，質量好，是一種較理想的食品添加劑。根據響應面法優化常壓蒸餾法提取鮮葉迷迭香精油工藝實驗結果表明，當采用新鮮的迷迭香嫩枝，水分含量為75.17%～75.22%，剪碎至2 cm大小，1 kg迷迭香鮮葉中加入純水1 L，料液比為1∶1時，常壓蒸餾法提取迷迭香精油的最佳工藝條件為：控制蒸餾速度2 滴/s，蒸餾時預加熱30 min，蒸餾液以1.0 g/dL添加固體NaCl，迷迭香精油提取率可達1.35%，精油提取率(以干物質計)可達5.44%。本研究實驗的過程與方法對相關研究具有一定的參考價值，可為常壓蒸餾提取迷迭香等香料植物精油提供一定的工藝參考。