響應面法優化黑皮雞樅總黃酮提取工藝

張晨，趙金，嚴俊杰，苗人云，林俊彬，李翔，周向榮，張攀，甘炳成*

(1.中國農業科學院都市農業研究所，成都 610213；2.成都大學 食品與生物工程學院，成都 610106；3.成都農業科技中心，成都 610213；4.金堂縣現代農業裝備產業園管理委員會，成都 610407；5.四川田嶺澗生物科技發展有限公司，成都 610400)

黑皮雞樅(Oudemansiellaraphanipes)又名卵孢小奧德蘑、長根菇，是一種適合工廠化栽培的高端珍稀食用菌[1-4]。黑皮雞樅香味濃郁、口感鮮嫩，不僅富含人體所需的蛋白質、脂肪、氨基酸，還含有多糖[5-7]、黃酮[8]等多種活性成分，而且具有極高的食用和藥用價值。目前，黑皮雞樅主要是以鮮品食用為主，包括炒菜、煲湯等，其子實體含有多種鮮味氨基酸、5′-核苷酸，具有成為天然健康型調味品原料的潛能[9]。

黃酮類化合物廣泛存在于各種食用菌中，具有抑菌、抗氧化、預防骨質疏松、抗過敏等功效[10-13]，因而受到研究者及健康產品開發人員的廣泛關注。然而，目前關于黑皮雞樅中黃酮的提取工藝研究較少且提取效率較低。基于此，本試驗擬采用單因素試驗和響應面法進行工藝優化，利用超聲波輔助乙醇法探索從黑皮雞樅中提取總黃酮的工藝條件，以期獲得一種操作簡單、提取率高的總黃酮提取工藝，為黑皮雞樅總黃酮的開發利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑皮雞樅子實體：中國農業科學院都市農業研究所栽培基地；蘆?。罕本┧魅R寶科技有限公司；無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、九水硝酸鋁：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

WP-UP-LH-20S理化分析型超純水機 四川沃特爾水處理設備有限公司；WGLL-125BE電熱鼓風干燥箱、FW177中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TX323L電子天平 島津菲律賓制造有限公司；FlexA-200酶標儀 杭州奧盛儀器有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝

黑皮雞樅子實體→烘干→粉碎→過篩(40目篩)→黑皮雞樅粉末→稱量→加入提取溶劑→超聲輔助提取→過濾→定容→測定黃酮。

1.2.2 黃酮標準曲線的制作

以蘆丁作為標準品，參考孫瓊[14]的方法進行黃酮的測定。以蘆丁對照品溶液的質量濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度(OD)值為縱坐標，得標準曲線方程y=0.0016x-0.0031，相關系數R2=0.9929。

1.2.3 黑皮雞樅總黃酮含量的測定

準確稱取1.00 g黑皮雞樅粉末，在一定體積、濃度的乙醇溶液基礎上，添加一定料液比的蒸餾水。通過功率300 W的超聲波處理，按照不同的超聲時間、超聲溫度提取黑皮雞樅總黃酮，過濾后收集提取液，定容至50 mL，搖勻，每組試驗重復3次。移取2 μL溶液至96孔板中，按照孫瓊的方法測定其吸光度，計算黑皮雞樅總黃酮的提取率，公式如下：

W=C×V/1000m×100%。

式中：W為黑皮雞樅菌總黃酮提取率(mg/g)；C為提取液中總黃酮的質量濃度(μg/mL)；V為供試總黃酮樣品液體積(mL)；m為黑皮雞樅粉末質量(g)。

1.2.4 單因素試驗

在1.2.1的提取工藝下，準確稱取黑皮雞樅粉末1.00 g，將黑皮雞樅總黃酮提取率作為指標，通過單因素試驗探究乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)、超聲時間(30，60，90，120，150 min)、超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)4個因素對黑皮雞樅菌總黃酮提取率的影響，并篩選出各因素的最適范圍，為響應面法優化試驗做好水平選取，每組試驗重復3次。

1.2.5 黑皮雞樅總黃酮提取工藝優化

采用Design Expert 8.0.6.1軟件，在單因素試驗基礎上，采用四因素三水平響應面試驗，對黑皮雞樅總黃酮的提取率進行響應面設計，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

1.3 數據處理

每組試驗處理重復3次，結果用平均值±標準差表示，采用Excel 2020、Design Expert 8.0.6.1和SPSS進行數據統計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同乙醇濃度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

由圖1可知，為探究不同乙醇濃度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響，選擇50%～90%乙醇濃度進行試驗。乙醇濃度從70%增加到80%時，提取率顯著提高，從2.28 mg/g提高到3.69 mg/g，可能是由于黑皮雞樅總黃酮的極性與乙醇極性接近[15]。但當乙醇濃度超過80%時，黑皮雞樅總黃酮提取率呈現降低趨勢，可能是因為黑皮雞樅中其他醇溶性雜質浸出的比例升高，降低了黃酮的溶解[16]。因此，選擇乙醇濃度為80%。

圖1 乙醇濃度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

2.1.2 不同液料比對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

由圖2可知，液料比對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響先增加后減小。當液料比在20∶1～40∶1 (mL/g)的范圍內時，黑皮雞樅總黃酮提取率顯著上升，這可能是接觸面積增加產生的結果。當液料比為40∶1～60∶1 (mL/g)時，黑皮雞樅總黃酮提取率緩慢下降，因為黑皮雞樅總黃酮溶出完全，且可能會造成其他雜質的溶出，抑制了總黃酮的提取[17]。因此，選擇液料比為40∶1 (mL/g)。

圖2 液料比對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

2.1.3 不同超聲時間對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲時間對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響先增加后減少。因為超聲時間增加會導致黑皮雞樅的細胞膜破壞程度增大，細胞膜內外會形成梯度差，有利于總黃酮類物質向乙醇溶液中擴散，因此提取率會增加[18]。當超聲時間為120 min時，黑皮雞樅中提取的總黃酮含量達到最大值4.08 mg/g。當超聲時間高于120 min時，黃酮具有的酚羥基會發生化學反應，導致總黃酮提取率下降[19]。因此，選擇超聲時間為120 min。

圖3 超聲時間對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

2.1.4 不同超聲溫度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲溫度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響較為明顯。當超聲溫度在40～70 ℃范圍內時，由于超聲溫度顯著增加，小分子間流動加快，有利于黑皮雞樅總黃酮的溶出。當超聲溫度在70～80 ℃范圍內時，黑皮雞樅的總黃酮溶出急劇減少。這可能是由于乙醇本身易揮發，溫度過高，黑皮雞樅總黃酮發生氧化分解，同時乙醇濃度加速降低，導致提取率陡然下降[20]。因此，選擇超聲溫度為70 ℃。

圖4 超聲溫度對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

2.2 黑皮雞樅菌總黃酮提取響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

以總黃酮提取率為響應值，使用Design Expert 8.0.6.1軟件進行Box-Behnken試驗設計，結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果

根據Design Expert 8.0.6.1軟件對表2中數據進行回歸分析。4個因素的編碼值二次回歸方程為：Y=4.82+0.45A+0.33B-0.17C-0.10D-7.500E-003AB-2.500E-003AC+0.14AD+0.21BC+0.20BD-0.28CD-0.99A2-0.64B2-0.56C2-0.34D2。

2.2.2 響應面回歸模型方差分析

通過Design Expert 8.0.6.1軟件進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，模型的P值<0.0001，表明模型顯著。失擬項的P值=0.0550>0.05(不顯著)，說明該模型誤差小。R2=0.9070，RAdj2=0.8141，說明模型擬合度較高，有18.59%的情況該模型無法解釋[21-23]。其中A、A2、B2、C2高度顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.0001)；B極顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.01)；D2顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.05)；其余因素對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響不顯著。根據F值與P值的大小分析，試驗范圍內各因素對總黃酮提取率的影響大小為A(乙醇濃度)>B(液料比)>C(超聲時間)>D(超聲溫度)。

2.2.3 響應面分析

為考察各因素交互作用對黑皮雞樅總黃酮提取率的影響，采用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應面圖，見圖5。響應面平面圖中，若等高線為圓形，則兩因素之間的交互作用較弱；若等高線為橢圓形，則兩因素之間的交互作用較強[24]。

圖5 各因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖及等高線

由圖5可知，黑皮雞樅總黃酮提取率的優化工藝條件中各因素等高線趨于圓形，結合模型方差分析結果，各因素的交互作用相對較弱(P>0.05)[25]。

2.2.4 驗證試驗

根據上述分析，發現各因素間的響應面和等高線與回歸方程分析結果吻合，根據Design Expert軟件預測的結果，得到黑皮雞樅總黃酮最優提取參數。結果顯示：乙醇濃度82.30%、液料比42.44∶1、超聲時間116.68 min、超聲溫度70.15 ℃時，黑皮雞樅總黃酮提取率預測值為4.91767 mg/g。結合理論預測和實際應用，優化結果表明，以82%乙醇為溶劑，42∶1 (mL/g)液料比處理117 min，超聲輔助提取總黃酮，重復3次試驗，黑皮雞樅總黃酮提取率平均值為4.89 mg/g。利用選定的最優條件檢驗模型方程預測最優響應值的適用性，結果吻合度較高，表明該優化工藝具有穩定性和可行性。

3 結論

本研究采用超聲輔助乙醇法，以最大限度地提高黑皮雞樅中總黃酮的提取率。通過Box-Behnken響應面設計，對乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度4個參數進行了優化，得到最佳提取條件：乙醇濃度82%，液料比42∶1 (mL/g)，超聲時間117 min，超聲溫度70 ℃。此條件下黑皮雞樅總黃酮提取率達到4.89 mg/g。該方法的黃酮提取量高且方法簡單，為黑皮雞樅黃酮在食藥用品、功能性調味品方面的應用奠定了基礎，提高了黑皮雞樅的附加價值。