miR-218靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路對甲狀腺癌細胞的影響

王 鋼，秦 鮮

(1.湖北省武漢市江夏區第一人民醫院，湖北 武漢 430200 2.武漢大學人民醫院消化內科，湖北 武漢 430060)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是一種常見的內分泌惡性腫瘤，病理學分型顯示我國最常見類型為甲狀腺濾泡狀癌與甲狀腺乳頭狀癌，分化良好的TC被認為是“惰性腫瘤”，患者的長期生存率可以高于95%[1]，而侵襲性TC具有近100%的疾病特異性死亡率[2]。20世紀80年代以后，許多國家TC的發病率繼續上升，相關數據統計發現，1974年到2013年間的平均發病率約為6.66%，TC已經是發病率排名第九的癌癥[3]。對TC發病機制及治療方式的研究尤為緊迫，微小RNA-218(MicroRNA-218,miR-218)是腫瘤抑制性miRNA的一種，在宮頸癌組織中低表達可以顯著促進宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，其作用機制可能與miR-218靶向調控TPD52蛋白有關[4]。miR-218在結腸癌組織中可以調控磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，抑制此通路的激活達到抑制結腸癌細胞侵襲和遷移的效果。相關研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路在TC組織中被激活，促進TC細胞的增殖，導致患者不良預后，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可以有效誘導TC細胞凋亡與自噬，有利于改善患者TC病癥[5]。因此本實驗以TC細胞為研究對象，探究miR-218靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，期望為PTC患者帶來新的曙光。

1 材料與方法

1.1細胞來源：人TC細胞株8505C(貨號：GD-C00136260)購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2主要試劑及儀器：LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(貨號：L3000001)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；總RNA提取試劑盒(貨號：R1200)購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液(貨號：abs9229)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；SD-001 MinuteTM總蛋白提取試劑盒(貨號：SD-001)購自晨學生物科技(廣州)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8試劑盒(貨號：P0012S、C0039)購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM basic(1X)高糖培養液(貨號：C11995500BT)購自廣州賽國生物科技有限公司；ki-67、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH兔源抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(貨號：A2094、A19080、A2095、A4860、AP0637、AP0115、A19742、A17909、A2445、A19056、AC005)均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；細胞培養箱(型號：WJ-80A-Ⅲ)購自上海海向儀器設備廠；酶標儀(型號XElx800)購自美國Perkin Elmer公司。

1.3細胞培養、分組與轉染：將8505C細胞置于含有1%雙抗與10% FBS的DMEM培養基中，使用24孔培養板于細胞培養箱中進行培養，培養氣象條件為5% CO2，95%O2，溫度設置為37℃。每兩天更換培養基一次，當細胞密度高于80%時進行胰蛋白酶消化傳代培養。將處于對數生長期的8505C細胞隨機分為：對照組(未處理的8505C細胞)、miR-218 NC組(轉染陰性mimics)、miR-218 mimics組(轉染miR-218 mimics)、通路激活劑組(未處理的8505C細胞)滴加PI3K/AKT/mTOR通路激活劑IGF-1至終濃度100 ng/mL[6]、miR-218mimics+通路激活組(轉染miR-218 mimics)滴加IGF-1至終濃度100 ng/mL。

1.4RT-QPCR法檢測8505C細胞中miR-218表達水平：參照RNA提取試劑盒說明書的要求提取8505C細胞中總RNA，根據逆轉錄試劑盒中說明書的要求反轉錄得到cDNA。miR-218引物序列：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；β-actin作為內參引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTTGATCTAA-3'，下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'?？偡磻w系為20μL：2×SYBR Mix10μL，H2O 8μL，上下游引物各0.5μL，10×cDNA模板1μL。反應條件設定為：95℃預變性30s，95℃變性30s、60℃退火延伸30s，共40個循環，72℃延伸50s。根據2-△△CT算法進行計算8505C細胞中miR-218的表達水平。

1.5CCK-8法檢測8505C細胞增殖能力：取1.3各組8505C細胞，將濃度調整為2×105個/孔接種至24孔培養板中，每組設置3個復孔，培養氣象條件為5% CO2，95%O2，溫度設置為37℃，在藥物處理的24h時后向每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，利用酶標儀檢測450nm處的吸光度(OD)值。

1.6劃痕實驗檢測8505C細胞遷移能力：取1.3各組8505C細胞，將濃度調整為2×105個/孔接種至24孔培養板中，將8505C細胞置于細胞培養箱(37℃、95%O2、5% CO2)中繼續培養24h進行觀察，待細胞鋪滿板內85%左右時，用10μL移液槍頭垂直于24孔板底部做直線劃痕，之后細胞繼續置于恒溫培養箱(37℃、95%O2、5% CO2)中培養后24h，于倒置光學顯微鏡下拍照(×100)觀察，利用Image J軟件測量劃痕區域面積，并計算細胞劃痕愈合率=1-24h劃痕面積/0h劃痕面積×100%。實驗進行3次重復。

1.7Transwell實驗檢測8505C細胞侵襲能力：對于8505C細胞侵襲能力測定步驟如下，將4×105個8505C細胞懸浮在200μL無糖與FBS的DMEM培養基中，將8505C細胞懸浮液加入到預先涂有Matrigel的Transwell上室中，同時向Transwell下室中加入600μL含10%FBS的DMEM培養基，常溫下孵育48h后，用棉簽擦除上室表面的細胞，將侵襲的細胞用4%的多聚甲醛固定15min，1%結晶紫染色20min，隨機選取3個視野利用顯微鏡觀察并計數，估算8505C細胞的侵襲能力。

1.8Western blot檢測8505C細胞中蛋白表達水平：取1.3各組8505C細胞濃度調整為2×105個/孔接種至24孔培養板中，使用RIPA裂解緩沖液中裂解30min，在4℃條件下以10000rpm離心10min，收集上清即獲得各組8505C細胞總蛋白。通過BCA試劑盒測定蛋白質濃度，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)方法將各組8505C細胞總蛋白分離出等量的蛋白質，使用濕轉法將分離出的各組等量蛋白質轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入一抗ki-67(1∶1000)、MMP-2(1∶2500)、MMP-9(1∶2000)、p-PI3K(1∶3000)、PI3K(1∶1000)、p-AKT(1∶3000)、AKT(1∶2000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶2500)、GAPDH(1∶1000)在4℃條件下孵育過夜，第2天再加入羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室溫下孵育2h。顯影并通過Image J軟件對目標條帶的灰度值進行分析，獲得各組8505C細胞總ki-67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達水平。

2 結 果

2.1各組8505C細胞中miR-218表達水平：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞中miR-218 mRNA表達水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞中miR-218 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞中miR-218 mRNA表達水平顯著下調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞中miR-218 mRNA表達水平顯著下調(P<0.05)，見表1。

表1 各組8505C細胞中miR-218 mRNA表達水平

2.2各組8505C細胞增殖情況：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞在24h時的OD450值變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞在24h時的OD450值顯著下調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞在24h時的OD450值顯著上調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞在24h時的OD450值顯著上調(P<0.05)，見表2。

表2 各組8505C細胞增殖情況

2.3各組8505C細胞遷移情況：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞劃痕愈合率變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞劃痕愈合率顯著下調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞劃痕愈合率顯著上調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞劃痕愈合率顯著上調(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 各組8505C細胞遷移情況

圖1 劃痕愈合實驗檢測各組8505C細胞遷移能力(×200)

2.4各組8505C細胞侵襲情況：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞侵襲數目變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞侵襲數目顯著下調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞侵襲數目顯著上調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞侵襲數目顯著上調(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 Transwell檢測各組8505C細胞侵襲能力(×200)

表4 各組8505C細胞侵襲數目比較

2.5各組8505C細胞中增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達情況：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)，見圖3，圖4。

圖3 Western Blot檢測各組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況

2.6各組8505C細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達情況：與對照組比較，miR-218 NC組8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，通路激活劑組8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)，見圖5和表5。

表5 各組8505C細胞中p-PI3K p-AKT p-mTOR蛋白表達情況

圖4 各組8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況

圖5 Western Blot檢測各組8505C細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白

3 討 論

TC是一種具有侵襲性的癌癥，手術、放射性碘及甲狀腺激素抑制劑等治療方式，有治愈TC的可能，但是患者出現淋巴結轉移等病理特征時，TC患者具有較差的預后，同時TC癌細胞顯示出有絲分裂增加的特征[7]。miRNA參與細胞分化、細胞增殖、信號轉導等多種途徑，具有成為治療靶點和生物標志物的潛力，通過對文獻檢索發現miRNA在TC細胞增殖、遷移與侵襲過程中發揮重要調控作用[8]。miR-218在腎細胞癌、前列腺癌、宮頸癌等多種腫瘤組織和細胞中低表達，發揮抑制細胞增殖及轉移的作用。當miR-218在口腔癌細胞UM1中過表達時可以逆轉口腔癌細胞UM1的耐藥性，促進其凋亡[9]。既往研究發現，miR-218在TC組織和細胞系中下調表達，且能夠抑制細胞遷移、侵襲和腫瘤生長[10]。但是，miR-218抑制TC細胞生物學行為的分子機制尚不清楚。因此本實驗以人TC細胞株8505C為研究對象，通過轉染miR-218 mimics發現，miR-218表達水平顯著上調，增殖能力、細胞劃痕愈合率、侵襲數目顯著降低，與之前的研究一致，說明上調8505C細胞中miR-218表達水平可以顯著抑制8505C細胞的增殖、遷移以及侵襲。ki-67是公認的評估細胞增殖活性的標志物之一，其過表達是TC復發的獨立危險因素[11]。MMP-2與MMP-9在TC患者體內的含量對于腫瘤的遷移與侵襲具有重要意義，其在TC患者體內水平顯著升高，意味著不良預后[12]。本實驗通過檢測不同處理的8505C細胞中的蛋白水平發現，轉染miR-218 mimics后，8505C細胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著下調，其結果表明，上調8505C細胞中miR-218表達水平對8505C細胞的增殖、遷移以及侵襲的抑制作用與降低ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達密切相關。

PI3K/Akt/mTOR信號通路的信號轉導對細胞的增殖、代謝與凋亡具有重要調控作用，在癌癥患者中此信號通路失調，其與癌癥的發生與發展具有密切關系。PI3K/Akt/mTOR信號通路異常激活會導致TC患者具有較差的預后[13]。使用白藜蘆醇可以抑制TC細胞增殖、遷移與侵襲，可能與其顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活有關。本實驗發現，過表達miR-218能夠降低8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平，這與上述研究結果一致，說明在8505C細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路處于激活狀態，可能導致腫瘤的進一步惡化，而上調8505C細胞中miR-218的表達可使原本的活化狀態被抑制，從而抑制細胞的增殖、遷移及侵襲，減緩腫瘤的進展過程。進一步使用PI3K/Akt/mTOR信號通路激活劑處理8505C細胞發現，通路激活劑組8505C細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著高于對照組，表明通路激活劑可以激活PI3K/Akt/mTOR信號通路；而且在轉染miR-218 mimics的基礎上加入通路激活劑后，miR-218對PI3K/Akt/mTOR信號通路的抑制作用被消除，同時，8505C細胞的增殖能力、細胞劃痕愈合率、侵襲數目及ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著上調，提示miR-218抑制8505C細胞增殖、遷移與侵襲的作用，可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活進而抑制ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達有關。

綜上所述，miR-218通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活抑制8505C細胞增殖、遷移與侵襲。PI3K/Akt/mTOR信號通路紛繁復雜，還有待進一步確認其它信號通路在此過程的調控作用，更需要臨床中檢驗miR-218在TC發生與發展中的作用。