基于網絡藥理學及分子對接技術分析蠲痹湯加減治療類風濕關節炎的作用機制*

亓偉鈺，李 鑫，滿榮勇，曹建中

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.懷化市第一人民醫院，湖南 懷化 418000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性關節滑膜炎癥、進行性骨侵蝕為主要臨床特征的自身免疫疾病。流行病學調查顯示，中國RA發病率為0.2%～0.4%，5年內致殘率高達40%～50%[1]。據中華醫學會風濕病學分會最新指南，RA常用藥物主要有甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺胺嘧啶等改善病情的抗風濕藥物，阿達木單抗、依那西普、托法替布等生物制劑，激素及非甾體類藥物四類。甲氨蝶呤、來氟米特等可以部分延緩RA炎癥進程，但臨床療效缺乏足夠的循證證據，且存在胃腸道不適、骨髓抑制、肝硬化、腎損害等諸多不良反應[2]。而新型生物制劑不僅價格昂貴，且30%患者存在首次治療失敗，二次治療不敏感等缺點，其安全性亦缺乏足夠的循證數據[3]。

蠲痹湯出自清·程國彭《醫學心悟》，由羌活、獨活、肉桂、秦艽、當歸、川芎、甘草、海風藤、桑枝、乳香、木香組成。全方溫而不燥，通而不傷正，“通治風、寒、濕三氣，合而成痹”。蠲痹湯也是國家中醫藥管理局頒布的《古代經典名方目錄（第一批）》入選方劑。臨床研究顯示，蠲痹湯單獨使用或聯合西藥治療RA具有一定療效，但多為單中心、小樣本的臨床研究（randomized controlled trial，RCT），其RCT方案設計和研究質量良莠不齊，尚缺乏其臨床療效及安全性的循證證據。同時，蠲痹湯治療RA的生物學機制研究較少，且僅聚焦于炎癥細胞因子。蠲痹湯原方中肉桂可通九竅，利關節。但肉桂長于補火助陽，引火歸原，而本病多以閉阻經絡，不通則痛為主。相與肉桂比較，桂枝藥性更加溫和，更善溫通經脈、通痹止痛，可用于治療關節痹痛。且營衛不和為痹證發病的重要原因。故本研究使用桂枝代替原方桂心進行研究。

基于此，本研究擬運用網絡藥理學與分子對接研究策略，探討蠲痹湯加減治療RA的潛在機制，以期為后續開展實驗研究提供參考。

1 方法

1.1 網絡藥理學預測

1.1.1 中藥活性成分及靶基因篩選 通過中藥系統藥理學與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別以羌活、獨活、桂枝、秦艽、當歸、川芎、甘草、海風藤、桑枝、乳香、木香為關鍵詞，檢索蠲痹湯加減所有成分。以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為篩選標準，獲得符合標準的藥物成分及靶基因。

1.1.2 RA相關靶基因篩選 基于GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和Drugbank(https://www.drugbank.ca）進行檢索。為明確蠲痹湯加減藥物相關靶點與RA靶點間的相互作用，利用微生信在線作圖平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制交集靶點的韋恩圖。

1.1.3 建立“中藥-有效成分-靶點”網絡 將藥物及其有效成分、靶點基因整理至Excel表格，利用Cytoscape 3.7.1軟件建立“中藥-有效成分-靶點”網絡圖，明確其有效成分。

1.1.4 RA與蠲痹湯加減共同靶點篩選及PPI建立 通過Excel將交集靶基因導入在線String數據庫（https://string-db.org），建立疾病靶基因蛋白互作網絡（PPI）模型，生物種類選擇“Homo sapiens”，設置置信度為≥0.9，隱藏游離靶點，得到PPI圖。通過Cytoscape 3.7.1中CytoNCA插件對網絡互作關系進行拓撲分析，篩選介數中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、局部連通性（local average connectivity-based method，LAC）、網絡中心性（network centrality，NC）均大于中位數的節點作為核心基因靶點。

1.1.5 交集靶點的GO與KEGG富集分析 通過GO數據庫及KEGG數據庫對蠲痹湯加減與RA共同靶點進行GO和KEGG通路富集分析，設定閾值≤0.5，GO分析選擇生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）3個部分進行，通路分析選擇KEGG，并繪制條形圖和氣泡圖。

1.2 分子對接

1.2.1 蛋白靶點及小分子結構準備 將degree值排名靠前的核心靶標和活性成分進行分子對接。從RCSB PDB數據庫（https://www.rcsb.org/structure）下載核心靶點蛋白晶體結構，采用Pymol 2.1軟件刪除蛋白分子中的無關小分子；從PBD數據庫下載化合物結構，通過Chem3D對所下載的化合物進行優化，并轉化為“mol 2”格式。將處理好的蛋白分子和小分子化合物導入AutoDock Tools1.5.6軟件進行常規預處理，并保存為“pdbqt”文件。

1.2.2 對接過程 將處理后的化合物作為小分子配體，蛋白靶點作為受體，根據小分子與靶點相互作用確定Grid Box的中心位置及長寬高。最后通過AutoDock進行批量分子對接，采用Pymol 2.1軟件進行可視化。使用Lamarckian遺傳算法進行分子對接計算，并根據結合自由能評估最終對接結構，分析化合物與靶蛋白的相互作用模式及與活性位點殘基作用情況。

2 結果

2.1 網絡藥理學結果

2.1.1 蠲痹湯加減活性成分及靶基因篩選 通過TCMSP數據庫對蠲痹湯加減進行檢索，篩選符合標準的有效成分共172個，其中羌活15個、獨活9個、桂枝7個、秦艽2個、當歸2個、川芎7個、甘草92個、海風藤21個、桑枝3個、乳香8個、木香6個，具體有效成分見表1。得到靶基因共11 213個，其中羌活1 243個、獨活650個、桂枝2 402個、秦艽157個、當歸864個、川芎1 356個、甘草2 506個、海風藤372個、桑枝204個、乳香659個、木香800個，獲得有效靶基因2 175個，刪除重復靶標，最終獲得223個靶標。

表1 蠲痹湯加減藥物組成的部分有效成分

2.1.2 RA相關靶基因的篩選 通過GeneCards、OMIM、TTD和Drugbank數據庫篩選RA相關靶標，得到靶基因4 958個，取相關度≥1的靶基因。GeneCards數據庫共獲得2 810個基因靶點；OMIM數據庫共獲得27個基因靶點；TTD數據庫共獲得141個基因靶點；Drugbank數據庫共獲得571個基因靶點；將其合并去除重復值，最終獲得RA相關靶點2 933個。基于RA相關靶點與蠲痹湯加減作用靶點之間的相互作用，將篩選出的疾病藥物靶點輸入微生信在線平臺獲取韋恩圖，結果顯示共有交集靶點157個。（見圖1）

圖1 蠲痹湯加減與類風濕關節炎共有靶點韋恩圖

2.1.3 中藥有效成分-靶點網絡建立 將收集到的有效成分及靶點的關系導入Cytoscape 3.7.1軟件，建立“中藥-有效成分-靶點”網絡圖，得到304個節點與1 383條相互作用關系。（見圖2）其中紫色代表藥物活性成分，藍色代表靶點基因。通過分析中藥-有效成分-靶點網絡獲得該網絡中與靶點聯系最為密切的成分為槲皮素、山奈酚、柚皮素。（見表2）

圖2 蠲痹湯加減中藥-有效分-靶點網絡圖

表2 與靶點聯系最密切的有效成分及相關信息

2.1.4 PPI網絡建立與核心靶點的篩選 將已獲得的交集基因靶點導入String在線數據庫進行分析，設定置信度≥0.9，隱藏游離基因靶點得到PPI網絡圖，圖中“邊”代表交集基因間的關聯，“邊”的粗細代表其結合度的大小，“邊”越粗，其結合度越大；節點為作用的交集基因。共得到節點數量157個，626條邊，平均節點度為7.97，平均局部聚類系數為0.493。使用Cytoscape3.7.1軟件對PPI網絡圖進行拓撲分析，得到核心靶點，Degree值排在前10位的為TP53、JUN、MAPK3、FOS、STAT3、MYC、MAPK1、ESR1、MAPK14、MAPK8。（見圖3）

圖3 蛋白互作網絡圖（A）和PPI 網絡核心靶點的篩選（B）

2.1.5 GO富集分析 通過對交集靶點的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）進行GO富集分析，繪制條形圖，條形柱的長度表示基因的數目，柱子越長說明富集在GO上基因的數目越多，柱子的顏色代表富集的顯著性（即P值），顏色越紅則說明富集到該功能的顯著性越高。（見圖4）結果顯示，交集靶點主要涉及氧化應激應答（response to oxidative stress）、脂多糖應答（response to lipopolysaccharide）、細菌來源分子應答（response to molecule of bacterial origin）、氧化應激（cellular response to oxidative stress）等生物過程；主要參與膜筏（membrane raft）、膜微區（membrane microdomain）、蛋白激酶復合物（protein kinase complex）等細胞成分的組成；主要發揮DNA結合轉錄因子的結合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子的結合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、核受體活性配體激活（nuclear receptor activity ligand-activated）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄激活因子活性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）等分子功能。

圖4 GO 富集分析條形圖

2.1.6 交集靶點的KEGG富集分析 通過對交集靶點進行KEGG通路富集分析，繪制氣泡圖，氣泡的大小表示基因的數目，氣泡越大說明富集在該通路上基因的數目越多，氣泡的顏色代表富集的顯著性，顏色越紅則說明在該通路上富集越顯著。結果顯示，蠲痹湯加減可能通過PI3K/Akt、AGE/RAGE、TNF、IL-17、雌激素受體、Th17細胞分化等通路發揮其對RA的治療作用。（見圖5）

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖

2.2 分子對接結果 將槲皮素（Quercetin）、柚皮素（Naringenin）及山奈酚（Kaempferol）化合物結構與JUN、MAPK3、TP53靶點蛋白進行分子對接。結果表明，多數化合物與蛋白的結合能＜-6 kcal/mol，存在較強的結合作用。（見表3）將對接后化合物與蛋白形成的復合物利用Pymol 2.1軟件進行可視化，得到化合物與蛋白的結合模式，可清晰地顯示化合物與蛋白口袋相結合的氨基酸殘基。化合物與靶點蛋白結合較好，存在多種相互作用，與靶蛋白活性位點的匹配度較高，是潛在的活性化合物小分子。（見圖6）

表3 化合物與靶蛋白對接結果

圖6 分子對接模擬圖

3 討論

中醫學認為RA屬于“痹證”范疇。機體正氣不足，又合時感風寒濕之邪，三氣挾雜入侵機體，痹阻經絡、關節、筋骨而發病。蠲痹湯加減以羌活、獨活為君藥，散一身上下之風濕，通利關節而止痹痛。臣以海風藤祛風通絡，止痹痛；桑枝祛風濕，利關節；秦艽祛風濕，清濕熱，止痹痛，三藥合用，共助君藥祛風濕止痛。佐以桂枝通經絡、利關節以止痛；當歸、川芎活血又補血，以防濕邪壅聚、痹阻脈道成為瘀血；乳香通經絡、止痹痛；木香行氣通滯。使以甘草溫調和緩。全方共奏祛風除濕、活血通絡、行氣止痛之功。

本研究共篩選出有效成分172個，從活性成分-靶點互作網絡構建結果中得知其關鍵活性成分主要有槲皮素、柚皮素及山奈酚等。從各味藥有效成分來看，其中獨活、羌活、當歸、川芎、桂枝、秦艽中均含有β-谷甾醇，木香含有谷甾醇。研究發現，β-谷甾醇可發揮抗炎作用，β-谷甾醇及其糖苷還可以增加T-淋巴細胞增殖，發揮免疫調節作用[4]。多味藥物共同發揮作用，能明顯增強其抗炎、免疫調節作用。滑膜炎是RA的主要表現，即滑膜受到外界刺激，出現大量增生，形成炎癥；FIRESTEIN G S等[5]認為RA組織滑膜異常增生的原因可能是滑膜細胞凋亡機制障礙。有研究表明羌活醇和異歐前胡素能抑制大鼠成纖維樣滑膜細胞的增殖，并具有抗炎的功效[6-7]。本研究顯示，羌活、獨活均含有異歐前胡素，且羌活最主要的成分即為羌活醇和異歐前胡素。本方以羌活、獨活為君藥，既散風寒、通利關節，又抑制滑膜增生、抗炎，可對RA起到關鍵治療作用。桑枝為臣藥，其主要成分為山奈酚、桑色素等，其中桑色素可通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導的內皮細胞炎癥反應，而山奈酚可通過調控bFGF-FGFR3-RSK2信號抑制滑膜細胞TNF-α、IL-17、IL-21表達[8]。當歸、海風藤、木香中含有豆甾醇成分，可助君藥治療骨關節炎[9]。此外，木香中的菜薊苦素可抑制炎癥介質和淋巴細胞增殖，可能是木香抑制TNF-α的主要成分[10]。乳香中含有乳香酸成分，在體外實驗中被證明有抗炎作用[11]。桂枝的有效成分花旗松素、表兒茶素均具有良好的抗炎作用，可作為治療類風濕關節炎的新藥進行研究[12-13]。使藥甘草中含有槲皮素、柚皮素等成分。有研究證實，槲皮素可通過抑制Th17/Treg平衡，抑制IL-17A、IL-21、TNF-α等細胞因子的表達而減輕關節炎大鼠炎癥反應[14]；柚皮素可通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子表達，抑制脾臟Th1和Th17細胞分化及NF-κB、MAPK等通路而改善關節炎小鼠或大鼠炎癥浸潤[15]。

GO及KEGG分析顯示，蠲痹湯加減治療RA可能與調控PI3K/AKT、AGE/RAGE、TNF、IL-17、雌激素受體、Th17細胞分化等通路有關。研究顯示，PI3K/AKT對RA慢性滑膜增生、血管翳形成及骨破壞3個病理環節均有促進作用[16]。AGE/RAGE信號通路可通過活化HMGB1進而活化NF-κB，介導RA炎癥細胞因子風暴，從而導致RA發生發展[17]。Th17細胞主要分泌IL-17、IL-21等炎癥細胞因子，具有促進炎癥反應、促進關節軟骨和骨破壞進程等多重效應[18]。

分子對接結果顯示，槲皮素、柚皮素及山奈酚與JUN、MAPK3、TP53等RA核心靶點蛋白具有較好的結合能力。TP53是RA的負向調節因子，TP53缺失可使滑膜細胞過度增殖，Treg分化受損，從而導致RA的發生發展[19]。JUN、MAPK3激酶是MAPK家族成員。MAPK通路是介導RA關節局部炎癥和骨質破壞的重要信號通路之一，對機體炎癥反應有抑制作用[20]。這些相互作用可以提高化合物的穩定性，可能是治療RA的潛在靶標。

綜上，蠲痹湯加減可能通過方中藥物的多種活性小分子，作用于免疫調節、抗炎等多個環節而發揮其整合效應治療RA。網絡藥理學多為預測性結果，旨在給予研究者相關的分子研究方向。后期研究應注重對預測關鍵靶標及通路進行相關藥理學研究以確證。