挖掘國家專利復方治療肝癌的用藥規律及分子機制*

姚元謙，呂建林，柳琳琳，王光耀，楊 坤

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023）

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，主要為肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinona，HCC），其病情發展迅速，死亡率高，5年生存率低于15%。我國屬于肝癌高風險地區，主要與慢性乙型肝炎病毒感染及黃曲霉毒素暴露有關。2020年我國肝癌新發病例41萬，死亡病例39萬，占全球肝癌死亡病例的51%，是我國惡性腫瘤死亡的第二大誘因[1-2]。目前治療肝癌的手段包括局部的手術、放療、消融、介入治療，以及全身性的化療、細胞免疫、靶向藥物治療等[3]。手術治療是早期肝癌的有效治療手段，但大部分患者確診時已是中晚期，故藥物干預是治療肝癌的重要手段。西醫藥物治療不良反應較多，長期服用西藥還可能產生耐藥性，患者預后不佳[4-5]。

中醫藥醫治腫瘤療效確切，具有抑制腫瘤生長、提高患者生存質量、減輕臨床癥狀等療效。中西醫聯合治療能夠減少西藥毒副作用、降低術后復發率、延緩病情進展，中醫藥防治腫瘤有著不可忽視的重要作用[6-7]。中醫學強調對疾病的整體把握，現代醫家通過辨證論治對肝癌進行治療，效果明顯，并總結出了許多專利復方。中醫藥專利復方均經過長期的臨床應用，取得了肯定的臨床療效，具有較高的可重復性。本次研究整合數據挖掘、GEO基因芯片分析、網絡藥理學及分子對接技術，進一步系統分析國家專利復方治療肝癌的用藥規律，及其核心藥物的潛在活性成分、作用靶點和調控途徑，并進行分子模擬驗證。

1 資料與方法

1.1 中藥處方來源 登錄國家知識產權公共服務網-專利檢索及分析系統（https://www.cnipa.gov.cn/），以“肝癌and中藥”為檢索詞，收集所有與肝癌相關的中藥復方。納入標準：（1）明確具有治療肝癌作用的中藥復方，且組方完整；（2）治療方法為口服，劑型不限；（3）藥味不限。排除標準：（1）治療對象為動物的中藥復方；（2）使用方法為外用的中藥復方；（3）藥物組成相同的中藥復方只納入一次。

1.2 數據規范處理 根據《中華人民共和國藥典》對納入的中藥進行名稱規范化處理，如“薏仁”規范為“薏苡仁”，“制軍”規范為“大黃”。將所得的中藥數據錄入Excel建立“肝癌處方用藥”數據庫。為確保信息錄入準確無誤，由兩名數據員交叉核對錄入。

1.3 數據分析 將“肝癌處方用藥”數據導入中醫傳承計算平臺V3.0軟件，選擇“數據分析模塊”下的“統計分析模塊”及“方劑分析模塊”，依次進行中藥的四氣、五味、歸經、功效、頻數、用藥模式分析，并篩選出國家專利復方治療肝癌的核心藥對。

1.4 獲取半枝蓮-白花蛇舌草的活性成分及靶點 對“1.3”項下分析得出的核心藥對進一步行生物信息學分析，檢索TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、SymMap（www.symmap.org）數據庫獲取半枝蓮-白花蛇舌草的活性成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件進行收集。

通過TCMSP數據庫下載各活性成分的mol2格式數據文件，依次上傳至PharmMapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預測各活性成分的潛在作用靶點，并以Norm Fit≥0.5為條件篩選出高概率靶點，然后將各靶點ID上傳至UniProt平臺（https://www.uniprot.org/）統一轉換為GeneSymbol。

1.5 挖掘GEO芯片獲取肝癌靶點 以“liver cancer”為關鍵詞檢索GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩選相關的基因芯片，獲取GSE84402芯片數據集，下載該芯片的表達數據及GPL570基因芯片注釋文件。該芯片數據包含肝癌組織樣本14例、癌旁組織樣本14例。

利用R軟件對芯片數據進行分組，應用“lima”“pheatmap”程序包，以|logFC|≥1、P＜0.05為篩選條件，獲取與肝癌相關的顯著性差異基因，分別選取上調基因與下調基因中的前20個基因繪制熱圖。

1.6 篩選共同靶點并構建PPI核心網絡 將“1.4”“1.5”項下的藥物、疾病靶點導入R軟件，應用“venn”程序包繪制藥物-疾病靶點Venn圖，并映射篩選出藥物-疾病交集靶點。將交集靶點提交至STRING平臺（https://string-db.org/）獲取PPI蛋白互作網絡，下載該網絡數據的TSV格式文件并導入Cytoscape 3.7.2進行拓撲分析，通過連接度（Degree值）的中位數篩選出半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的核心靶點。

1.7 生物信息富集分析 將“1.6”項下的交集靶點導入R軟件，應用“clusterProfiler”“DOSE”“org.Hs.eg.db”等程序包，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）富集分析和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析。

1.8 構建活性成分-靶點-通路網絡 為了更清晰地展示半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的作用機制，運用Cytoscape 3.7.2軟件繪制活性成分-基因靶點-作用通路網絡圖，并通過Degree值預測半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的主要活性成分。

1.9 分子對接驗證 選取“1.8”項中主要活性成分的前5個作為小分子配體，選取與這5個活性成分連接度最高且是“1.6”項下的核心靶點作為蛋白受體。從TCMSP數據庫下載主要活性成分的MOL2文件，從PDB數據庫（https://www.rcsb.org）下載蛋白受體的pdb文件，使用PyMOL軟件刪除蛋白受體的水分子及配體，運用AutoDockTools1.5.6軟件確定蛋白受體的活性口袋，最后通過AutoDock Vina軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 藥物頻數及藥對分析 通過檢索統計，共獲得315首中藥專利復方，549種藥物，累計出現4 646次。統計顯示，頻數≥40的藥物有21味。（見表1）設置支持度≥10%（約等于30次）、置信度≥90%進行核心組合篩選。結果顯示，治療肝癌的常用藥對有半枝蓮-白花蛇舌草、黃芪-白術、白術-茯苓等。（見表2）

表1 國家專利復方治療肝癌的常用藥物統計

表2 國家專利復方治療肝癌的常用組合分析

2.2 藥物性味歸經及功效分析 四氣主要為寒性（1 475次）、溫性（1 203次）、平性（778次）；五味主要為苦味（2 168次）、甘味（1 670次）、辛味（1 355次）；主要歸經為肝經（2 204次）、脾經（1 591次）、肺經（1 422次）、胃經（1 157次）、心經（1 052次）；藥物功效以補虛、清熱、活血化瘀為主。（見圖1）

圖1 國家專利復方治療肝癌的藥物功效分析

2.3 篩選半枝蓮-白花蛇舌草及肝癌靶點 篩選獲得33個藥物活性成分，通過PharmMapper數據庫得到396個藥物靶點。對GSE84402芯片數據進行差異分析，共獲得差異基因1 423個，其中在肝癌中表達上調的基因480個（如CCNB1、CDKN3、RACGAP1等），在肝癌中表達下調的基因943個（如FCN2、ABCA8、OIT3等）。分別選取上調基因與下調基因的前20個繪制熱圖，圖中綠色為低表達，黑色為中表達，紅色為高表達。（見圖2）

圖2 肝癌組織與正常組織差異基因熱圖

2.4 獲取交集靶點并構建PPI核心網絡 將藥物-疾病靶點數據導入R軟件，繪制Venn圖（見圖3），并映射篩選出交集靶點80個。構建交集靶點的蛋白互作網絡，進行拓撲分析發現，該網絡的核心靶點有ESR1（28）、AR（20）、TYMS（20）、CDK1（19）、CYP1A1（16）、MMP9（16）、CCNB1（16）、IGF1（15）等，提示這些靶點在半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌中發揮著關鍵作用（見圖4）。圖中節點越大、顏色越深表示連接度越高。

圖3 藥物-疾病靶點Venn 圖

圖4 交集靶點PPI 拓撲分析圖

2.5 生物信息富集分析 應用R軟件對80個交集靶點進行富集分析，得到生物過程（BP）條目716條，主要包括藥物反應、酒精代謝過程、激素代謝過程、類固醇代謝過程等；得到細胞組分（CC）條目39條，主要在分泌顆粒腔、胞質囊泡腔、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等處發揮作用；得到分子功能（MF）條目68條，主要包括組蛋白激酶活性、類固醇結合、氧化還原酶活性等；得到信號通路31條，主要富集在化學致癌作用通路、細胞色素P450對外源性藥物的代謝作用通路、p53信號通路、花生四烯酸代謝等通路等信號通路。對主要條目進行繪圖，見圖5～6。

圖5 半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌靶點GO 富集分析圖

圖6 半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌靶點KEGG 富集分析圖

2.6 構建活性成分-靶點-通路網絡 為了更加明確半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的活性成分、基因靶點與作用通路之間的關系，故構建網絡圖。（見圖7）其中紅色倒三角形節點為通路，藍色圓形節點為靶點，黃色正方形節點為活性成分，節點越大說明連接度值越大。通過網絡圖可直觀看出，半枝蓮-白花蛇舌草對肝癌具有多途徑、多成分的作用機制。根據Degree值，預測其治療肝癌的主要活性成分見表3。

圖7 半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的活性成分-靶點-通路網絡圖

表3 半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的主要活性成分

2.7 活性成分與靶點蛋白的分子對接 選取“2.6”項下的主要活性成分與“2.4”項下的核心靶點進行分子對接驗證，運用AutoDock Vina軟件進行對接并預測結合能力，結合能越低則構象越穩定，當結合能＜0 kcal/mol時表明配體與受體間有結合活性，當結合能＜-5.0 kcal/mol時表明結合良好[8]。結果顯示，木犀草素-ESR1（-8.2 kcal/mol）、β-谷甾醇-TYMS（-7.5 kcal/mol）、豆甾醇-IGF1（-7.1 kcal/mol）、漢黃芩素-CYP1A1（-10.5 kcal/mol）、槲皮素-CDK1（-9.0 kcal/mol）與靶點蛋白分子間具有較強的結合活性。（見圖8）

圖8 各主要活性成分與核心靶點的分子對接圖

3 討論

肝癌可歸屬于中醫學“積聚”“臌脹”“黃疸”等病證范疇，當代醫家認為本病總屬本虛標實，其病理因素與瘀毒、氣滯、血瘀、痰凝等相關[9]。本研究通過挖掘國家專利數據庫發現，當代醫家治療肝癌以補虛藥（如黃芪、白術、當歸）、清熱藥（如白花蛇舌草、半枝蓮、茵陳）、活血化瘀藥（如莪術、丹參、三七）等為主。《醫宗必讀》指出：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，故治療肝癌時應重視補益人體正氣，并配之以治標，祛癌毒邪氣、散氣血積滯、消痰濕聚結。當代醫家治療肝癌時以固本培元、標本兼治為治療法則。在性味方面，以寒溫平、苦甘辛使用為主，寒性藥可清熱解毒，而溫性藥一方面能制約寒藥攻邪太過，另一方面能起到溫運痰濕、暖肝溫脾的功效，苦味能瀉能燥，能清瀉濕熱、化解瘀毒。甘味能補，補益人體正氣、恢復臟腑功能。藥物歸經以肝經、脾經、肺經、胃經等為主。治肝的同時應重視對脾胃的顧護。肝、脾在生理活動中聯系密切，若脾胃化源充足、氣機升降相宜，則肝氣條達、肝血充盈、疏泄正常，且肝木太過容易橫犯脾土，正所謂“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”[10]。

國家專利復方治療肝癌的核心藥對為半枝蓮-白花蛇舌草，兩者均有一定的抗腫瘤活性。半枝蓮具有廣泛的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等生物活性[11]。研究發現，半枝蓮提取物能夠逆轉上皮-間充質轉化，從而抑制肝癌細胞的遷襲[12]。白花蛇舌草同樣有廣泛的抗癌作用，能夠促進腫瘤細胞凋亡、增強免疫功能[13]。但兩者抗腫瘤的作用機制仍未完全明確，故本次研究通過生物信息學進一步分析半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的潛在機制。

半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的核心靶點有ESR1、AR、TYMS、CDK1、CYP1A1、MMP9、CCNB1、IGF1、PTGS2 等。ESR1（雌激素受體1）作為一種癌基因，是多種惡性腫瘤潛在的腫瘤抑制基因，在乳腺癌、非小細胞肺癌及宮頸癌中，ESR1的表達水平明顯下調[14-15]。研究表明ESR1也是肝癌的腫瘤抑制基因，低ESR1表達會促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]，相反，ESR1的過度表達可以抑制肝癌細胞發展，同時誘導肝癌細胞的凋亡[17]。AR（雄激素受體）屬于核受體超家族中的類固醇受體，實驗發現肝癌中的巨噬細胞可能通過改變外泌體中的microRNA（miR-92a-2-5p）來降低肝癌細胞AR的表達，從而促進肝癌細胞的侵襲[18]。TYMS（胸苷酸合成酶）是臨床中化療藥物的作用靶點，被認為是氟尿嘧啶類藥物的主要作用部位[19]。研究發現，TYMS基因在肝癌中表達上調，可促進肝癌細胞DNA的合成，使腫瘤生長、擴散[20]。CDK1（周期蛋白依賴性激酶1）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期調控中的重要因子。CDK1在包括肝癌在內的多種腫瘤組織中表達上調，且與肝癌患者的預后相關，高表達的CDK1肝癌患者其預后較差[21]。CYP1A1（細胞色素P450 1A1酶）是細胞色素P450氧化酶家族成員之一，是體內重要的Ⅰ相代謝酶，在多種致癌物的活化和解毒過程中起著重要的作用[22]。研究發現，CYP1A1基因突變者更易發生肝癌，其危險性是CYP1A1基因未突變者的3.8倍[23]。基質金屬蛋白酶9（MMP9）屬于基質金屬蛋白酶家族（MMPs）成員，參與正常生理過程中細胞外基質的分解。MMP9與腫瘤的發生及進展有關，當MMP9表達上調降解細胞外基質和基底膜，腫瘤細胞由此進入體循環形成新的腫瘤灶，同時MMP9能促進新血管的生成以維持腫瘤生長[24]。有研究[25]認為，MMP9與肝癌生長浸潤及轉移過程關系密切，可作為腫瘤分子標志物。CCNB1（細胞周期蛋白B1）與腫瘤關系密切，參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲等過程，在各種惡性腫瘤中呈過度表達[26]。實驗表明，通過降低CCNB1表達能夠抑制肝癌細胞的增殖及侵襲[27]。IGF1（胰島素樣生長因子1）參與肝臟的生理活動，影響肝細胞周期的進程、生長，且IGF1與各種肝臟疾病相關，在肝炎、肝硬化、脂肪肝及肝癌中表達下調。動物實驗、體內外實驗及流行病學調查均有證據表明IGF1對肝癌細胞具有調節作用[28]。PTGS2（前列腺素內過氧化物合成酶2）與炎癥反應密切相關。研究[29]認為，炎癥反應是促進肝癌發展的因素，抑制PTGS2/COX-2可以防止黃曲霉毒素驅動肝癌的發生及進展。

交集靶基因GO功能富集分析顯示，半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌主要涉及藥物反應、酒精代謝過程、類花生酸代謝過程、環氧酶P450途徑、分泌顆粒腔、胞質囊泡腔、蛋白激酶活性。乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶是酒精代謝過程中的兩個關鍵酶，這兩種酶類分別由ADH、ALDH基因進行編碼。研究認為酒精代謝可能與肝癌的進展有關。與正常組織相比，肝癌組織中ADH1和ALDH2基因的表達水平顯著下降，且這兩種基因低表達的患者其術后復發率高、生存時間短[30]，而上調ALDH2表達能夠抑制肝癌細胞的增殖[31]。環氧酶P450生物途徑能夠將花生四烯酸代謝為具有生物活性的類花生酸，類花生酸是包括炎癥在內的許多生物過程的關鍵調節劑，研究發現其能抑制肝臟炎癥[32]。KEGG通路富集分析得到31條信號通路，主要富集在化學致癌作用通路、細胞色素P450對外源性物質的代謝通路、p53信號通路、FoxO信號通路、花生四烯酸代謝等通路，富集在通路上的基因出現較多的有PIK3R1、IGF1、CYP1A1、CYP1A2、ADH1C等。細胞色素P450傳導通路負責藥物、內源性物質及外源性物質的生物轉化，此通路對肝癌細胞的生長起調控作用，并可影響化療藥物的療效[33]，而CYP1A1、CYP1A2是該通路激活癌前物質的主要基因之一[34]。p53信號通路與腫瘤的發生關系密切，其重要節點p53基因通常在癌癥患者中發生突變或失活，從而導致異常腫瘤細胞生長[35]。有研究證實，通過miR-29b調控p53信號通路能夠抑制肝癌細胞增殖，并誘導肝癌細胞凋亡[36]。FoxO信號通路與轉錄有關，參與細胞周期控制、細胞凋亡、糖代謝等生理過程。研究表明FoxO因子是腫瘤抑制因子，低水平的FoxO與肝癌患者的不良預后相關，且可能增加對化療藥物的耐藥性[37]。

半枝蓮-白花蛇舌草治療肝癌的主要活性成分可能為木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素、槲皮素等。上述化合物均具有抗腫瘤作用，部分可增加抗腫瘤藥物的敏感性。研究[38-42]表明，這些化合物在抗肝細胞癌方面具有多樣的作用機制，能夠抑制肝癌細胞的增殖、浸潤、轉移、侵襲，并能促進癌細胞凋亡。

本研究利用分子對接技術進行虛擬驗證，對主要的活性成分與核心靶點進行對接分析，結果顯示所有對接結合能均＜-5.0 kcal/mol，表明各主要活性成分與核心靶點間具有良好的結合力。

綜上所述，在治療肝癌的國家專利復方中，使用最多的藥組為半枝蓮-白花蛇舌草，表明其可能在治療肝癌中發揮著重要作用。半枝蓮-白花蛇舌草中的木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素、槲皮素等活性成分，能上調ESR1、IGF1及下調PTGS2、MMP9、AR、TYMS、CDK1、CYP1A1、CCNB1 等核心 靶點，調控化學致癌作用通路、細胞色素P450代謝通路、p53信號通路、FoxO信號通路等，通過藥物反應、酒精代謝過程、類花生酸代謝過程、環氧酶P450活性等生物功能，抑制肝癌細胞的增殖、侵襲、擴散及對藥物的耐藥性。本次分析也從側面反映了國家專利復方治療肝癌的機制是多途徑、多成分、多功能的，但此研究仍需進一步實驗驗證。