磁性活性細(xì)胞分選法對(duì)新鮮和冷凍精液優(yōu)化效果的研究

陳娟 張蔚 高麗娜 劉帝佐

精子優(yōu)選技術(shù)作為輔助生殖技術(shù)的重要環(huán)節(jié)之一，與妊娠結(jié)局有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，男性精液中DNA損傷精子仍具有受精能力，但卻影響受精后的胚胎發(fā)育潛能或?qū)е屡咛グl(fā)育的異常[1]。因此，通過精子優(yōu)選技術(shù)去除雜質(zhì)、碎片和冷凍保存液，獲得高前向運(yùn)動(dòng)活力、高細(xì)胞形態(tài)正常以及高DNA完整率、少損傷、無(wú)凋亡的精子的精子懸液是提高輔助生殖技術(shù)(assisted reproduction technique，ART)成功率和安全性的重要保障。磁性活性細(xì)胞分選法(magnetic activated cell sorting，MACS)作為新興的精子優(yōu)選技術(shù)，其原理是通過膜聯(lián)蛋白V偶聯(lián)的磁珠特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻(凋亡)的精子，在磁場(chǎng)的作用下篩選出未凋亡的精子[2]。本文通過研究MACS對(duì)新鮮精液與冷凍精液的優(yōu)選效果，從精子前向運(yùn)動(dòng)活動(dòng)率(PR%)、DNA完整率等多個(gè)方面探討對(duì)其優(yōu)化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床廣泛應(yīng)用MACS優(yōu)選精子提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：在北京地區(qū)招募科研志愿者，簽訂知情同意書后留取精液?？蒲兄驹刚呷脒x條件為成年男性，年齡20～45周歲，身體健康，無(wú)傳染性疾病且精液質(zhì)量符合《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)[3](簡(jiǎn)稱：WHO5手冊(cè))健康人群標(biāo)準(zhǔn)，精子濃度≥15×106/mL，PR%≥32%。

2.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：miniMACS starting kit和Dead cell removal kit購(gòu)于德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司；精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒(SCD法)和精子活體染色(伊紅-苯胺黑染色法)試劑盒購(gòu)于博銳德生物科技有限公司；QUINNS Sperm Wash Medium(ART-1006)購(gòu)于秒泉儀器有限公司；生物顯微鏡(奧林巴斯CX41，日本)。

3.研究方法：

(1)分組。收集20例健康男性精液，精液完全液化后分為兩份，每份1 mL精液，設(shè)置兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，一組做新鮮精液的MACS優(yōu)化(新鮮精液組)，一組制備為冷凍精液，解凍后進(jìn)行冷凍精液的MACS優(yōu)化(冷凍精液組)。記錄每份精液優(yōu)選處理前后的精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率、膜完整性、正常形態(tài)率及DNA碎片率。

(2)新鮮精液標(biāo)本優(yōu)化前預(yù)處理?？蒲兄驹刚呓?～7 d，通過手淫法獲取精液至無(wú)菌容器內(nèi)，將該容器置于37℃水浴鍋中液化30 min，待精液全部液化后吸取1 mL精液樣本進(jìn)行項(xiàng)目研究。

(3)冷凍精液標(biāo)本的制備及優(yōu)化前預(yù)處理。①冷凍精液標(biāo)本制備。精液標(biāo)本完全液化后，精液和甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護(hù)劑以2∶1的比例混勻，30℃平衡10 min后，將冷凍管置于液氮面懸掛熏蒸10 min，最后浸入液氮內(nèi)保存。

②冷凍精液優(yōu)化前預(yù)處理。從液氮中提取精液冷凍管，放置于37℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行解凍，待精液樣本完全解凍后進(jìn)行項(xiàng)目研究。

(4)磁珠活性細(xì)胞分選法(MACS)。測(cè)定精液樣本優(yōu)化前各項(xiàng)參數(shù)后，取1 mL精液樣本，按照精液濃度每10×106個(gè)精子加入80 μL 1×結(jié)合緩沖液和20 uL MACS Annexin V磁珠，混勻后室溫孵育15 min，使用ART-1006進(jìn)行洗滌，離心后去上清，加入1×結(jié)合緩沖液重懸精子沉淀，將精子懸液置于磁場(chǎng)分選柱中，用1×結(jié)合緩沖液沖洗分選柱，重復(fù)3次，收集沖洗液，沖洗液離心后去上清，加入0.5 mL ART-1006重懸精子沉淀。最后置37 ℃溫箱內(nèi)進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的檢測(cè)。

(5)精液動(dòng)態(tài)學(xué)檢測(cè)。參考WHO5手冊(cè)[3]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)活力分為前向運(yùn)動(dòng)、非前向運(yùn)動(dòng)和不運(yùn)動(dòng)三個(gè)等級(jí)，計(jì)算前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)占總精子數(shù)的百分比，得出前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率(PR%)。由于在自然受孕中使卵子受精的大部分為前向運(yùn)動(dòng)精子，故在輔助生殖實(shí)驗(yàn)室里常使用PR%來(lái)評(píng)估精子質(zhì)量。

(6)精子形態(tài)學(xué)檢測(cè)。使用WHO5手冊(cè)[3]推薦形態(tài)學(xué)染色方法(巴氏染色法)對(duì)精子進(jìn)行涂片染色，鏡下觀察至少200個(gè)精子，判斷是否畸形，計(jì)算正常精子占總精子數(shù)的百分比，得出精子正常形態(tài)率。

(7)精子細(xì)胞膜完整性檢測(cè)。利用精子活體染色法(伊紅-苯胺黑染色法)對(duì)精子進(jìn)行涂片染色。若精子細(xì)胞膜不完整，則頭部染為紅色或暗粉色；若完整，頭部為白色或淡粉色。40倍鏡下觀察至少200個(gè)精子，計(jì)算細(xì)胞膜完整的精子占總精子數(shù)的百分比，得出精子細(xì)胞膜完整率。

(8) 精子DNA完整性檢測(cè)。使用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法(Sperm Chromatin Dispersion，SCD)。檢測(cè)精子DNA完整性，40倍鏡下觀察至少500個(gè)精子，根據(jù)精子頭部光暈大小判斷該精子是否含有DNA碎片的精子(圖1)，計(jì)算DNA完整的精子占總精子數(shù)的百分比，得出精子DNA完整率。

①：為精子DNA碎片判定圖示，其中A為精子頭部最小直徑，B為單側(cè)光暈厚度，當(dāng)B≤1/3 A則表明精子存在DNA碎片；②、③：DNA完整的精子；④、⑤：存在DNA碎片的精子

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.新鮮精液和冷凍精液優(yōu)化前后前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率比較:通過MACS優(yōu)化后，新鮮精液組和冷凍精液組PR%無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但冷凍精液組優(yōu)化后PR%低于優(yōu)化前，見表1。

表1 MACS優(yōu)選前后PR比較

2.新鮮精液和冷凍精液優(yōu)化前后形態(tài)學(xué)變化:新鮮精液組和冷凍精液組精液經(jīng)MACS優(yōu)化后，正常形態(tài)率、精子膜完整率、DNA完整率均得到優(yōu)化，優(yōu)選前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中MACS對(duì)新鮮精液組膜完整性和冷凍精液組DNA完整性的優(yōu)化效果差異顯著(P<0.01)。見表2、圖2。

表2 MACS優(yōu)選前后精子各項(xiàng)形態(tài)參數(shù)對(duì)比

①：新鮮精液組(優(yōu)選前)；②：新鮮精液組(優(yōu)化后);③：冷凍精液組(優(yōu)化前)；④：冷凍精液組(優(yōu)化后)

討論

近年來(lái)，不孕不育癥逐漸成為影響人類健康和發(fā)展的一個(gè)全球性醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問題。自1978年首例“試管嬰兒”的誕生,ART開始進(jìn)入人們的視線，并且因?yàn)槠浒踩?、高效以及質(zhì)量保證，受到患者的信賴。精子優(yōu)選技術(shù)作為輔助生殖領(lǐng)域中保障其質(zhì)量重要的環(huán)節(jié)之一，與妊娠結(jié)局有著密切的聯(lián)系。

研究表明，精子DNA完整性是正常受精、著床和胚胎發(fā)育的必要條件[4]，精子DNA碎片 (Sperm DNA Fragmentation，DFI)會(huì)影響自精和供精體外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的受精、卵裂、胚胎質(zhì)量、胚胎種植和臨床妊娠結(jié)果[5-6]。所以精子優(yōu)選技術(shù)不僅需要去除精液中的雜質(zhì)，提高前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率以及細(xì)胞形態(tài)正常率，更要提高精子DNA完整性，從而保障精液質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局。MACS作為新興的精子優(yōu)選技術(shù)，可以很好的去除凋亡精子，顯著提高DNA完整率。本研究通過MACS對(duì)新鮮和冷凍精液優(yōu)化效果進(jìn)行研究，從多方面尤其是DNA完整率方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床廣泛應(yīng)用MACS優(yōu)選精子提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，MACS可通過篩選細(xì)胞膜上PS外翻的精子，優(yōu)化新鮮和冷凍精液的正常精子形態(tài)率、膜完整性和DNA完整率(P<0.05)，對(duì)于新鮮精液組的膜完整性和冷凍精液組的DNA完整性的優(yōu)化效果差異顯著(P<0.01)。這表明MACS可有效去除畸形精子、凋亡精子，獲得高DNA完整率的精液，其結(jié)果與以往對(duì)新鮮精液優(yōu)化的MACS研究結(jié)果基本一致[7-8]。值得注意的是精子畸形包括存在頭部、中段、主段等類型，本研究MACS對(duì)新鮮精液和冷凍精液組進(jìn)行優(yōu)化后，其正常形態(tài)率也只達(dá)到(25.78±1.95)%和(13.72±4.58)%，這表明在經(jīng)過MACS優(yōu)化的精液中畸形精子仍然占有很大的百分比；在改善精液前向運(yùn)動(dòng)率方面，MACS不能顯著改善新鮮精液的前向運(yùn)動(dòng)率(P>0.05)，且冷凍精液的前向運(yùn)動(dòng)率不僅沒有得到改善，反而降低。推測(cè)在新鮮和冷凍精液中都存在細(xì)胞膜和DNA完整但運(yùn)動(dòng)活力差或沒有運(yùn)動(dòng)活力的精子，MACS無(wú)法有效去除此類精子，因此不能顯著提高精子的前向運(yùn)動(dòng)活動(dòng)率，且精子受冷凍的影響，可能存在細(xì)胞膜和DNA完整卻喪失了活動(dòng)的動(dòng)力的現(xiàn)象，故冷凍精子經(jīng)MACS優(yōu)化后，其精子前向運(yùn)動(dòng)活動(dòng)率反而降低。綜上所述，MACS可以很好的優(yōu)化新鮮和冷凍精液的正常精子形態(tài)率、膜完整性和DNA完整率，在IVF和ICSI中有很高的應(yīng)用價(jià)值，但MACS不能顯著提高精子前向運(yùn)動(dòng)活動(dòng)率，故在自精和供精人工授精(artificial insemination，AI)的應(yīng)用中存在局限性。

細(xì)胞膜上PS外翻是細(xì)胞早期凋亡的特征之一，先于DNA碎片化[2]。雖然MACS不能很好的提高精液的前向運(yùn)動(dòng)活率，但MACS可以篩選出細(xì)胞膜PS未外翻的未凋亡精子，有效消除DNA碎片化的精子，保障胚胎發(fā)育潛能，改善ART夫婦的生殖結(jié)局[9]。研究表明，MACS對(duì)比密度梯度離心法 (density-gradient centrifugation，DGC)對(duì)于IVF的臨床結(jié)果無(wú)差異，但有助于選擇最具生育能力的精子，顯著改善ICSI受精周期中臨床結(jié)局[10-11]。另外，也有學(xué)者將MACS與DGC相結(jié)合優(yōu)選精子，結(jié)果顯示，MACS-DGC可以顯著提高精子質(zhì)量，在改善精子DNA完整性的同時(shí)提高前向運(yùn)動(dòng)活率[12-13]。在臨床研究方面，早在2010年就有利用MACS優(yōu)選新鮮精子后行ICSI成功妊娠分娩健康嬰兒的報(bào)道[14]，并逐漸應(yīng)用到Kartagener綜合征等男性不育癥的輔助生殖治療[15]。

MACS在輔助生殖領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景和臨床研究?jī)r(jià)值，本文中使用了20名志愿者的精液標(biāo)本，樣本量偏少，僅分析比較精液相關(guān)質(zhì)量參數(shù)，缺乏后期臨床試驗(yàn)，如比較受精率、優(yōu)胚率及妊娠率等情況。MACS在輔助生殖領(lǐng)域的推廣仍需更多的樣本量以及更多全面的研究才能得以實(shí)現(xiàn)。