新型光觸發(fā)一氧化氮供體的設(shè)計(jì)與合成*

易靜雯，劉艾文，黃 甜，李贇贇，黃 佩，王 芹，李 玟，張晟瑞

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

一氧化氮(NO)是由NO聚合酶內(nèi)源性的合成，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中，它在心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)中都不可或缺[1]。然而，任何事物都具有兩面性，過量的NO會(huì)產(chǎn)生毒副作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此NO的精準(zhǔn)釋放和量的控制對(duì)于實(shí)現(xiàn)其醫(yī)學(xué)、藥理作用非常重要[2]。NO供體是一種在生物體內(nèi)經(jīng)過簡易酶解或其他作用后釋放出NO的化合物，它在儲(chǔ)存、運(yùn)輸NO的同時(shí)能有效地克服它壽命短、半衰期短等缺點(diǎn)，其能夠自發(fā)地或是在施加合適的刺激(即溫度、pH、光)時(shí)從特定的分子和大分子支架中釋放NO。其中，光照是一種無創(chuàng)調(diào)控NO釋放的手段，具有時(shí)空控制和照射波長/強(qiáng)度可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前，設(shè)計(jì)一個(gè)可以在活細(xì)胞中通過光觸發(fā)來精準(zhǔn)釋放NO且具有高NO含量的供體仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)課題組設(shè)計(jì)合成了多種NO供體。例如，Zhang等[4]開發(fā)了一種由上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)作為光響應(yīng)核，介孔二氧化硅作為光敏劑構(gòu)建的納米平臺(tái)，由近紅外光響應(yīng)，按需釋放NO治療和光動(dòng)力療法，用于協(xié)同治療難治性角膜炎。該供體在808 nm的近紅外光照射后，核殼結(jié)構(gòu)的納米平臺(tái)將近紅外光子轉(zhuǎn)換為紫外光，以觸發(fā)基于7-氨基-4-甲基香豆素的NO供體釋放NO。Shen等[5]開發(fā)了一種可以在體外根除銅綠假單胞菌生物膜，并在體內(nèi)治療皮膚膿腫的NO供體。該供體以香豆素為熒光團(tuán)，在鈀(II)四苯基四苯并卟啉的存在下，可以在630或700 nm的深紅光照射下激活328 nm處具有最大吸光度的NO供體，從而通過光解催化并以8%的光解量子產(chǎn)率釋放NO。Sortino等[6]報(bào)道了一種通過可見藍(lán)光激活的NO供體。該供體以氨基硝基苯并呋喃為顯色骨架，在溶液中以0.15的量子產(chǎn)率釋放NO，釋放前后發(fā)色部分的熒光發(fā)射的對(duì)比大于10，容易實(shí)時(shí)且定量的釋放NO。Parisi等[7]設(shè)計(jì)并合成了一種靶向DNA釋放NO的供體。該供體將吖啶橙通過烷基間隔基與N-亞硝基苯胺衍生物共價(jià)連接。僅在綠光刺激下釋放NO，在黑暗中停止，并在綠光再次打開時(shí)重新開始。其中，吖啶橙部分的通過外部和部分插入方式與DNA結(jié)合，這種與生物聚合物的雙模結(jié)合作用允許NO在DNA附近以以自由分子類似的效率生成。Shen等[8]合成了一種水溶性的熒光NO供體。568 nm處紅色熒光隨著525 nm的照射而增加，該供體以羅丹明作為熒光團(tuán)，引入N-亞硝基作為NO釋放單元，親水嗎啉基團(tuán)不僅提高了NO供體的水溶性，還作為定位基團(tuán)可靶向定位溶酶體。這為了解溶酶體中NO的生物學(xué)效應(yīng)提供了良好的平臺(tái)。

氨基喹啉因?yàn)榫哂歇?dú)特的共軛結(jié)構(gòu)以及光學(xué)特性，使得大部分氨基喹啉類衍生物的溶液都能表現(xiàn)出比較強(qiáng)的熒光。同時(shí)含有氨基和三氟甲基的喹啉具有強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光，并具有大的斯托克斯位移。基于以上，本文以7-氨基-4-(對(duì)甲苯基)-2-(三氟甲基)喹啉為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了N-亞硝基化的新型NO供體TQ-NO。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

熒光分光光度計(jì)(F-4600)，日本日立公司；紫外分光光度計(jì)(UV-2600)，日本島津公司；型手持紫外檢測(cè)燈(F-7A)，上海光豪分析儀器有限公司；核磁共振波譜儀(600 MHz)，德國布魯克公司；質(zhì)譜儀(micrOTOF-QⅡ型)，德國布魯克公司。

4,4,4-三氟-1-(4-甲苯基)-1,3-丁二酮(5 g)，阿拉丁公司，其它化學(xué)試劑均為AR試劑。

1.2 供體TQ-NO的合成

圖1 TQ-NO的合成路線Fig.1 Synthesis route of TQ-NO

熒光團(tuán)AQ的合成[9]：合成路線如圖1所示，取間苯二胺(0.5 g，4.63 mmol)、4,4,4-三氟-1-(4-甲苯基)-1,3-丁二酮(1.0 g，4.63 mmol)溶于15 mL的CHCl3中，80 ℃下冷凝回流36 h后蒸發(fā)濃縮得到粗品。用氯仿重結(jié)晶后，用石油醚:乙酸乙酯:甲醇=20:1:1為洗脫劑柱層析分離純化得到黃綠色固體AQ。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ(ppm) 8.04 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.93～7.91 (m, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.35～7.33 (m, 3H), 7.06～7.04 (m, 1H), 4.16 (s, 2H), 2.43 (s, 3H). HRMS:m/zcalcd for C17H13F3N2[M+H]+: 303.11017; found: 303.11036。

TQ的合成[10]：合成路線如圖1所示，取AQ(0.64 g，2.12 mmol)、K2CO3(0.4 g)和NaI(0.04 g)溶于20 mL的無水乙腈中，常溫?cái)嚢?5 min后加入7 mL溴乙酸叔丁酯，82 ℃下冷凝回流54 h后使用60 mL乙酸乙酯、水進(jìn)行萃取/反萃取3次，以石油醚:乙酸乙酯:甲醇=20:1:1為洗脫劑，柱層析法分離純化得到亮黃色固體TQ。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ(ppm)8.04(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.90(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.34(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.04～7.06(m, 1H), 4.84(s, 1H), 3.97(d,J=4.5 Hz, 2H), 2.44(s, 3H), 1.53 (s, 9H). HRMS:m/zcalcd for C23H23F3N2O2[M+H]+: 417.17847; found: 417.17844。

TQ-NO的合成[11]：合成路線如圖1，取TQ(0.5 g，1.2 mmol)溶于25 mL乙酸中，避光條件下少量多次加入NaNO2固體。在冰水浴中攪拌6 h后加入15 mL蒸餾水，避光條件下抽濾并將沉淀用水洗滌三次，以石油醚:乙酸乙酯:甲醇=100:1:1為洗脫劑，柱層析法分離純化得到亮黃色固體TQ-NO。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ(ppm) 8.24 (d,J=9.11, 1.4 Hz, H), 8.19～8.15 (m, 2H), 8.13～8.07 (m, 3H), 7.41～7.34 (m, 2H), 4.75 (s, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.47 (s, 9H). HRMS:m/zcalcd for C23H22F3N3O3[M+H]+: 445.16477; found: 446.16556。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將一定量的TQ-NO溶于二甲基亞砜中作儲(chǔ)備液(1 mmol/L)。在10 mL比色管中依次加入500 μL的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)、100 μL儲(chǔ)備液，用水定容至5 mL，搖勻后取部分于比色皿中測(cè)定其紫外吸收及熒光發(fā)射(激發(fā)波長為360 nm)。然后用365 nm的便攜式紫外燈照射比色皿，間隔一定時(shí)間測(cè)量數(shù)次。激發(fā)/發(fā)射狹縫為5.0 nm/5.0 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜的變化

光控NO供體經(jīng)光觸發(fā)后裂解，釋放出NO，熒光恢復(fù)。圖2是TQ-NO釋放NO的路徑示意圖。圖3為光誘導(dǎo)TQ-NO釋放NO的熒光發(fā)射譜圖。照射前，熒光信號(hào)十分弱，在365 nm紫外燈照射后，431 nm處的熒光信號(hào)隨著照射時(shí)間增加而逐漸升高(圖3a)，在40 min后趨于穩(wěn)定(圖3b)。

圖2 TQ-NO釋放NO的示意圖Fig.2 Schematic diagram of NO release from TQ-NO

圖3 365 nm 紫外光照射后TQ-NO的熒光發(fā)射(a)及動(dòng)力學(xué)(b)譜圖Fig.3 Fluorescence emission (a) and kinetic(b) spectra of TQ-NO after UV irradiation at 365 nm

2.2 吸收光譜的變化

圖4為TQ-NO釋放NO的紫外吸收譜。供體TQ-NO的最大吸收在285 nm處，隨著365 nm紫外光持續(xù)照射，285 nm以及366 nm處的吸收值都逐漸降低(圖4a)，在40 min左右達(dá)到穩(wěn)定(圖4b)，與熒光發(fā)射光譜所得到的結(jié)果一致。

圖4 365 nm 紫外光照射后TQ-NO的吸收(a)及動(dòng)力學(xué)(b)譜圖Fig.4 Absorption (a) and kinetic(b) spectra of TQ-NO after UV irradiation at 365 nm

2.3 干擾性能測(cè)試

供體TQ-NO溶液中加入不同干擾離子后，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，如圖5所示(測(cè)量時(shí)干擾離子濃度均為0.25 mmol/L)。結(jié)果表明，一些還原性物質(zhì)可以加快供體釋放NO的速率，其中，加入亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉后最為明顯。

圖5 加入不同離子后溶液熒光強(qiáng)度變化圖Fig.5 Fluorescence intensity change diagram of solution with different ions

3 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)新型光控NO供體TQ-NO。該供體由7-氨基-4-(對(duì)甲苯基)-2-(三氟甲基)喹啉為熒光團(tuán)，具有良好的熒光性能。TQ-NO本身無熒光信號(hào)，在365 nm的紫外光照射下快速釋放出NO，同時(shí)熒光信號(hào)增強(qiáng)，可通過熒光信號(hào)的變化去實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NO的釋放量。與已有的NO供體相比，TQ-NO具有良好的光控性和抗干擾性等優(yōu)點(diǎn)。