雷公藤甲素脂質體粉霧劑的處方工藝篩選與評價*

史亞玲，李淼蘭，謝立穎，姚志喻，陳 卉

(桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 541199)

肺癌是發病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一，對人類健康構成嚴重威脅。根據2018 年WHO統計數據顯示，全球新發肺癌病例超過200萬人，因肺癌導致的死亡人數超過170萬[1-2]，給家庭和社會帶來巨大挑戰。

雷公藤甲素(Triptolide,TP)是從衛矛科植物雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、免疫調節和抑制腫瘤等藥理作用[3-5]。TP可通過抑制肺癌細胞增殖、誘導肺癌細胞凋亡以及抑制癌細胞轉移等發揮治療肺癌作用[6-7]。雖然TP具有高效治療肺癌活性，但給藥后主要在肝臟代謝，肝毒性明顯，化學結構修飾和脂質體等納米遞藥系統等方法一定程度上可降低其全身毒性[8]，仍需要根據疾病情況開發新型給藥方式。

肺部給藥是一種非侵入性的局部給藥方式，可直接作用于病灶，避免全身給藥造成的生物利用度低和毒副作用，可減小給藥劑量[9]。而以脂質體為載體的粉霧劑給藥后可形成儲庫，達到長效緩釋效果；并具有給藥劑量小、肺部靶細胞藥物沉積量高等特點，降低毒性的同時提高治療指數[10]。因此，圍繞增效減毒的目的，本實驗制備雷公藤甲素脂質體，凍干后得到了雷公藤甲素脂質體粉霧劑，為雷公藤甲素治療肺癌提供了新策略和實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

LC-20AD高效液相儀,日本島津；Evolion201紫外可見分光光度計,賽默飛世爾；TGL-16C高速離心機,上海安亭；ME204E電子天平,梅特勒-托利多；S10-3磁力攪拌器,上海司樂；N-1300旋轉蒸發儀,日本東京理化；Nano ZS激光粒度儀,英國馬爾文；SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機,寧波新芝；ALPHA1-2凍干機,德國Christ；顯微鏡,日本 OLYMPUS。

1.2 材 料

雷公藤甲素原料藥(純度>95%)，桂林三棱生物科技有限公司；蛋黃卵磷脂,北京索萊寶；膽固醇,上海阿拉丁公司；吐溫80,北京索萊寶；乙腈(TEDIA，色譜純)；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇等試劑(分析純),西隴科學。

2 實驗與結果

2.1 雷公藤甲素含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相:乙腈:水=35:65(V/V)；檢測波長：217 nm；流速：1.0 mL/min；溫度：30 ℃；進樣量20 μL。

對照品溶液精密稱取TP對照品11 mg，用無水甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中定容，制成1.1 mg·mL-1標準品的儲備液。

供試品溶液取雷公藤甲素脂質體溶液，加無水甲醇超聲破乳離心，取上清液過0.22 μm的濾膜，取續濾液即得。

空白對照溶液 取空白脂質體溶液，加無水甲醇超聲破乳離心，取上清液過0.22 μm的濾膜，取續濾液即得。

2.1.2 專屬性

取對照品溶液、供試品溶液及空白脂質體溶液1 mL于液相瓶中，按“2.1.1”項色譜條件進行分析。

圖1 TP對照品、TP供試品、空白脂質體的HPLC圖譜Fig.1 HPLC diagram of TP,TP-L,blank liposome

結果顯示，使用HPLC檢測TP含量，TP峰型較佳，出峰時間在10 min左右，空白脂質體無干擾，表明此方法測定TP含量的專屬性良好。

2.1.3 TP標準曲線的繪制

精密吸取TP標準品儲備液，配置成濃度為0.0226、0.0679、0.0905、0.1131、0.1357、0.1810、0.2262 mg·mL-1TP標準系列溶液。根據“2.1.1”項色譜條件進行測定，以濃度(C)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程為A=14927316C+260982(r2=0.999)，該結果說明TP溶液其濃度在0.0226～0.2262 mg·mL-1范圍內相關性良好。

2.1.4 精密度試驗

將濃度為20、40、100 μg·mL-1的TP標準溶液，于“2.1.1”項下的色譜條件重復分析5次進樣，測出其峰面積，并計算RSD。其峰面積RSD值分別為1.03%、0.98%、1.06%，均小于2%，表明精密度良好。

2.1.5 加樣回收率

往空白脂質體溶液中加入不同體積的雷公藤甲素溶液，用甲醇分別配制成15、50、100 μg·mL-1的不同濃度的樣品，依據“2.1.1”項的色譜條件，對所制備的樣品進行5次進樣，測定峰面積，計算雷公藤甲素濃度和加樣回收率。加樣回收率結果分別為：99.38%、101.96%、98.73%，RSD <2%，表明該方法測定TP的準確度高。

2.2 乙醇注入法制備TP脂質體

2.2.1 載藥及空白脂質體的制備

稱取適量卵磷脂、膽固醇、雷公藤甲素于燒杯中，加入2 mL無水乙醇攪拌使完全溶解；將此溶液緩慢滴入10 mL純水中，在磁力攪拌器上以300 rpm攪拌0.5 h，用超聲波細胞破碎儀處理10 min，旋蒸回收乙醇溶劑，透析后得到雷公藤甲素脂質體混懸液(TP-L)，于4 ℃條件下保存。采用相同方法制備其空白脂質體。

往上述脂質體樣品中加入凍干保護劑，溶解搖勻后置西林瓶中，凍干12 h，過180目篩即可得到TP-LD，置干燥器內保存備用。

2.2.2 處方工藝

單因素考察：以包封率及載藥量為指標對Tween-80用量、藥脂比、反應溫度、反應時間4個因素進行考察。

凍干保護劑：根據凍干粉外觀、粒徑和流動性等指標，篩選不同種類及合適比例的凍干保護劑。

表1 單因素設計水平表Table 1 Single factor design level table

表2 凍干保護劑種類篩選Table 2 Screening of freeze-drying protective agents

通過對雷公藤甲素脂質體的處方和工藝進行單因素篩選，可以得出用乙醇注入法制備雷公藤甲素脂質體的較優處方為蛋黃卵磷脂16 mg、膽固醇4 mg、雷公藤甲素原料藥2 mg。雷公藤甲素屬于脂溶性藥物，主要是嵌入在脂質層中，藥物量過多會影響脂質層的分子結構，從而包封率降低，保持磷脂比例不變，增加原料藥的投入量，可以發現當投入藥量增加到2 mg時，脂質體的包封率和載藥量都有明顯的提高。適量的0.5%Tween-80-乙醇溶液可以促進雷公藤甲素的溶解，減少因雷公藤甲素不完全溶解造成包封率低的誤差，并起到潤滑和乳化的作用。乙醇注入法制備雷公藤甲素脂質體，載藥溫度和載藥時間對包封率的影響也較大。經過考察，發現隨著載藥溫度的升高，雷公藤甲素脂質體的包封率也有明顯增高的趨勢，而載藥時間則對雷公藤甲素脂質體的包封率影響不大，考慮到耗時耗材問題，最終選擇載藥溫度55 ℃、載藥時間0.5 h來制備雷公藤甲素脂質體。

表3 單因素考察結果Table 3 Results of single factors

2.2.3 工藝驗證

根據上述單因素實驗中得出制備TP-L的條件，即Tween-80 2.5 mL、藥脂比為1:10、載藥溫度55 ℃、載藥時間0.5 h，按此法制備3批較優的TP-L樣品，按“2.2”項下方法測定TP-L包封率及RSD。

表4 驗證試驗結果Table 4 Verification of test results

2.3 制劑學評價

2.3.1 外觀形態

圖2 加入不同凍干保護劑的粉霧劑外觀Fig.2 Appearance of powder mist with different types of lyophilized protectants

加入不同的凍干保護劑，觀察樣品的外觀、復溶速度。從圖2可以看出，加入甘露醇凍干保護劑的TP脂質體凍干粉呈白色，且飽滿，加入蔗糖的TP脂質體凍干粉呈白色，貼壁，萎縮。不同凍干保護劑對粉霧劑外觀、復溶速度有影響，從表5結果可知，甘露醇對脂質體粉霧劑保護效果較好，樣品復溶速度較快。

表5 不同凍干保護劑對脂質體凍干粉的影響Table 5 Effects of different lyophilized protectants on lipid body freeze-drying powder

2.3.2 流動性、松密度

將TP-LD通過下孔徑為5 mm的玻璃漏斗，并從10 cm的高度緩慢、均勻地落入平板上，形成圓錐體。測量圓錐體的高度(h)和基底的半徑(r)，按公式計算休止角(θ，tanθ=h/r)。粉末休止角為38.7°，說明粉末流動性較好。取量筒，以自由落體方式裝入脂質體凍干粉，記錄質量與體積，計算得松密度約0.24 g/mL。

2.3.3 包封率和載藥量的測定

取適量TP-L溶液和TP-LD復溶后樣品，加甲醇破乳、離心取上清液過0.22 μm濾膜，續濾液按“2.1.1” 項下色譜條件進樣測定。計算總藥量(W總)、包封率(EE)和載藥率(LE)，計算公式如下。

(1)

(2)

2.3.4 粒徑及Zeta電位

取適量TP-L和復溶后的TP-LD 樣品溶液，用超純水稀釋10倍，利用馬爾文激光粒度分析儀測定其粒徑大小及Zeta電位值。取適量TP-LD樣品，加液體石蠟充分攪拌分散后，于正置顯微鏡下觀察并測定粉霧劑粒徑大小，平均粒徑為(1.17±0.047) μm，顯微鏡下粉霧劑形狀見圖3(C)。復溶前后包封率、粒徑及Zeta電位變化結果見表6。

表6 LTP及LTPD復溶后包封率、粒徑、電位結果Table 6 Results of entrapment efficiency, particle size and potential of LTP and LTPD after redissolution

按照篩選的方法制備的脂質體包封率約74.6%，凍干后的包封率約為72.9%，凍干前后包封率數據差別不大。于馬爾文粒徑儀下檢測，結果顯示凍干前的溶液粒徑約為113 nm，電位約為-43 mV，凍干后的電位約為-35 mV。 取TP脂質體凍干粉復溶液適量，用純化水再次稀釋到約100倍，在電鏡下測得凍干后的粒徑為1.17 μm左右。

圖3 TP-L 粒徑圖(A),TP-L Zeta電位圖(B),TP-LD粒徑圖 (C,100×R=1.1 μm),復溶后的TP-LD Zeta電位圖(D)Fig.3 TP-L particle size distribution (A),TP-L zeta potential(B),TP-LD particle size distribution (C,100×r=1.1 μm),TP-LD zeta potential(D)

2.3.5 肺部沉積率的測定

分別稱取30 mg雷公藤甲素脂質粉霧劑裝入3號羥丙甲纖維素膠囊中, 然后取上述膠囊10粒, 逐粒置于藥粉吸入器內, 連續吸入10粒, 每次10 s, 停泵后打開測定儀, 用10 mL無水乙醇清洗每個接收盤 (裝置、喉部、1～8級共10個接收盤), 連續2次, 合并后轉入50 mL量瓶, 將量瓶中的液體用無水乙醇定容，參考“2.1.1”項色譜方法測定每個接收盤中雷公藤甲素的含量, 按公式計算藥物肺部沉積率 (FPF)，測得FPF為20.57%。

(3)

2.3.6 體外釋放度評價[11]

對于多數固體劑型來說，藥物的溶出速度直接影響藥物的吸收速度。采用動態透析法進行原料藥TP與TP-LD體外釋藥評價。

圖4 TP-LD和TP原料藥的體外釋放圖Fig.4 In vitro release diagram of TP-LD and TP

分別取TP原料藥和LTPD適量，用3 mL人工肺液完全分散后置于透析袋(截留相對分子質量8000～14000)，以50 mL含0.2%Tween-80的人工肺液為釋放介質，控制溫度為37±0.5 ℃，轉速100 r·min-1，分別于5、10、15、30、40、60、90、120、180、240、300、480、720、1440、2160、2880 min取樣1 mL，同時補充同溫等量釋放介質。采用“2.1.1”項所建立的HPLC法測定TP含量并計算制劑的溶出度。以時間為橫坐標，以藥物累積釋放百分率為縱坐標繪制體外釋放曲線。

由以上結果表明，雷公藤甲素脂質體粉霧劑和雷公藤甲素原料藥在24 h后，體外釋放曲線趨于平緩。雷公藤甲素脂質體粉霧劑在人工肺液里釋放24 h后，累計釋放量達到約62.5%，而雷公藤甲素在24 h后，累計釋放量達到約87.1%。由此可見在人工肺液中，雷公藤甲素脂質體粉霧劑同原料藥相比，具有明顯的緩釋效果。

3 結 論

雷公藤甲素具有抗炎和抗腫瘤等藥理活性，但常規制劑的全身毒副作用較大。吸入粉霧劑與其他肺吸入劑型如氣霧劑、霧化吸入溶液相比，具有攜帶方便、穩定性更好以及靶向遞送病灶等優勢，適合肺癌治療。根據文獻以及預實驗結果，本實驗采用乙醇注入法和冷凍干燥法制備的雷公藤甲素脂質體粉霧劑，凍干前和復溶后粒徑、Zeta電位及雷公藤甲素包封率變化不大，處方工藝簡單可行，穩定性和粉體學參數良好。接下來，本項目將進一步評價粉霧劑的空氣動力學參數特征，并進行體內外抗肺癌療效評價，為雷公藤甲素脂質體粉霧劑的開發提供更充足的實驗數據。