紫外可見分光光度法測定化橘紅中總黃酮的含量*

李幸穗，黃淑慧，郭俐麟

(廣州衛生職業技術學院，廣東 廣州 510000)

我國中醫藥文化歷史悠久，中醫藥乃中華優秀傳統文化寶庫中非常重要的組成部分，是中華民族的國粹。中草藥是預防、治療疾病的重要手段，中草藥種類繁多、資源豐富、療效確切，既能防治常見病、多發病，還可治療疑難病癥。近年，新冠肺炎疫情肆虐，在總結我國國內疫情防控救治工作經驗的基礎之上，中國積極分享防控經驗，贏得了國際社會的普遍贊譽與高度評價，對中醫藥的走向世界起到了推動作用。

化橘紅又名“化州橘紅”，是較為常見的止咳化痰中藥，屬于廣東省道地藥材，出產于廣東省茂名市化州市，是中國國家地理標志性產品。《本草綱目拾遺》記載化橘紅可以治痰癥、消油膩、谷食積、醒酒、寬中、解蟹毒，《嶺南采藥錄》也記載化橘紅味苦辛、性溫平、無毒。化橘紅是一種名貴中藥材，具有散寒燥濕，利氣消疾，止咳、健脾消食等功效，有“南方人參”之稱。2006年，化橘紅被列入國家地理標志產品保護，2012年，化橘紅(中藥文化)入選廣東省非物質文化遺產項目，同年化橘紅被列入《美國藥典》。目前化橘紅類的藥材主要包括正毛橘紅、副毛橘紅、光橘紅、光黃橘紅等品種。

化橘紅主要有效成分有黃酮類化合物，還含有香葉醇、芳樟醇、枸櫞酸等成分，其中最主要是柚皮苷、野漆樹苷和新橙皮苷等[2]。前二者含量之和占化橘紅總黃酮類總量的84%以上，因此，在現有的質量控制標準中常常把柚皮苷或野漆樹苷作為化橘紅的關鍵質量控制指標。實驗室條件下提取化橘紅黃酮類化合物主要有索氏回流提取法[3]、超聲波法[4]和酶解輔助法[5]等，目前總黃酮含量測定方法有UV、TLC、HPLC、HPLC/MS等方法[6]。為準確測定化橘紅中總黃酮的含量以及最佳提取工藝，本文選取水浴回流加熱提取法進行研究，采取紫外可見分光光度法測定樣品中總黃酮的含量，簡便快捷，適用于化橘紅產品的提取和質量控制，為化橘紅制劑開發提供有效依據。

1 設備與實驗材料

1.1 主要設備

752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S2數顯恒溫水浴箱，金壇市醫療儀器廠；DHG-9203A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；4500A多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；BS224S萬分之一天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗材料

化橘紅，化州市礞石山橘紅發展有限公司；柚皮苷對照品(批號：110722-201815，含量91.7%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純)，天津市百世化工有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市百世化工有限公司。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的配制

取柚皮苷對照品8.0 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，并加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mL含柚皮苷80 μg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

將化橘紅去除雜質，置80 ℃烘箱干燥4 h至恒重，粉碎，過60目篩，取橘紅粉末適量(約0.5 g)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密量取無水乙醇50 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流70 min，室溫放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液0.125 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定波長選擇的方法

以50%乙醇為空白，在200～400 nm 范圍內，分別對對照品溶液與供試品溶液進行光譜掃描，選擇最大吸收波長作為測定波長。

2.4 標準曲線的制備

精密量取2.1項下對照品溶液1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品系列溶液。以50%乙醇為空白，在283 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.5 精密度實驗

精密量取2.1項下對照品溶液2.5于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后連續測定6次，計算結果。

2.6 穩定性實驗

取2.2項下供試品溶液，在放置0、10、30、60、90、120 min后，按照“2.4”項下方法在283 nm處分別測定吸光度，計算結果。

2.7 重復性實驗

取2.2項下供試品溶液，每份約 0.5 g，精密稱定，按照2.2項下供試品溶液制備方法平行制備5份樣品，按照“2.4”項下方法在283 nm處分別測定吸光度，計算測定結果。

2.8 加樣回收率實驗

按照高、中、低3個質量濃度梯度，精密稱取已測含量的化橘紅粗粉(已知總黃酮含量為15.92%)樣品9份，精密加入一定量柚皮苷對照品溶液，至燒瓶中，按照“2.2”項下制備樣品，按擬定方法測定A值，計算加樣回收率。

3 結 果

3.1 最佳吸收波長的選擇

通過光譜掃描圖發現，兩者光譜圖基本一致，且在283 nm(±1 nm)處有最大吸收，因此，選取最大吸收283 nm作為測定總黃酮的測定波長。

3.2 線性關系考察結果

按2.4方法進行考察，標曲曲線測定結果為，回歸方程：A=0.0252C-0.0103，相關系數r=0.9999(A為吸收度；C為濃度，μg·mL-1)，實驗結果表明，該方法測定化橘紅中總黃酮含量在12～28 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

3.3 精密度考察結果

按2.5方法進行精密度考察，測得對照品溶液平均濃度為20.11 μg/mL，RSD為0.1%，表明該方法測定結果的精密度良好。

3.4 穩定性考察結果

按2.6方法進行穩定性考察，化橘紅中總黃酮含量平均值為15.96%，RSD為1.1%，結果表明，該方法測定供試品溶液在2 h內穩定性良好。

3.5 重復性考察結果

按2.7方法進行重復性考察，化橘紅中總黃酮含量平均值為15.89%，RSD為1.5%，結果表明，該方法測定化橘紅中總黃酮含量的重現性良好。

3.6 加樣回收率考察結果

按2.8方法進行加樣回收率考察，結果表明，平均回收率為100.8%，其RSD為1.7%(回收率=測得量-藥材×含量%/對照品加入量×100%)。

表1 加樣回收率試驗(n=9)Table 1 Sample recovery test(n=9)

3.7 化橘紅中總黃酮含量測定

按照2.2項下試供品溶液制備方法制備樣品三份，再按照“2.4”項下方法在283 nm處測定吸光度，計算試供品溶液濃度C，然后按下式計算總黃酮含量。測定化橘紅中總黃酮平均含量為15.92%。

提取率=C×D(稀釋倍數)×V(提取體積)/原材料質量×100%

總黃酮含量=C×D(稀釋倍數)×V(提取體積)

4 討 論

根據陳永剛等[8]、彭穎等[9]、王雯等[10]、韋英杰[11]和龐瑞等[12]的研究結果，總黃酮得率差異性很大，究其原因，可能是所用化橘紅品種不同[13]，以及提取方法有差異等有關。化橘紅中黃酮類化合物的提取方法有很多，包括回流提取法、超聲波提取法等，回流提取法使用較多，它利用了黃酮類化合物在有機溶劑中溶解度較大的原理，將黃酮類化合物直接從化橘紅中萃取出來。根據黃酮類化合物及其雜質的極性大小不同，選取適宜的有機溶劑，如甲醇、乙醇、乙醚、石油醚等。

超聲波提取法[3]利用了超聲波的空化效應、擾動效應、擊碎效應，熱力效應等與傳統溶劑萃取法相結合的原理，連續產生的高壓不斷地沖擊細胞壁，使之破裂，從而使內容物釋放至提取溶劑中，物質交換次數隨碰撞次數不斷增多，使得細胞膜透過能力也得以增強，從而使得黃酮類化合物溶解進入到溶劑的速度增加，此外，化合物在試劑中溶解性的增強可提高其提取率，縮短提取時間。此法操作簡便方便，所需時間相對較少，提取率較高。本研究在進行化橘紅最佳提取工藝(試供品溶液制備)確定時，采用均勻設計，選用超聲提取法及水浴加熱回流提取法進行對比，采用100%乙醇在45 ℃超聲提取提取60 min得出的提取率為10.90%；85%乙醇水浴加熱回流提取50 min得出的提取率為11.05%，100%乙醇水浴加熱回流提取70 min得出的提取率為15.92%，以此確定提取溶劑為100%乙醇，提取方法為加熱回流提取法。

黃酮類化合物檢測方法較多，包括單一的分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法等。在實際工作中，薄層色譜法適用于藥物的定性分析，也曾經用于化橘紅中黃酮單體含量的定量分析，但現在大多被高效液相色譜法所代替，目前該法主要適用于化橘紅的品種鑒定。高效液相色譜法常用于黃酮單體含量的測定，如化橘紅中柚皮苷的含量測定等。高效液相色譜-質譜聯用法是最新的檢測技術，不僅可用于化橘紅中黃酮類化合物的定性及定量分析，還可以提供黃酮類化學物豐富的結構信息，具有非常強大的組分鑒定及檢測能力，分析檢測成本較高。紫外可見分光光度法常用于藥物的定性與定量檢測中，具有專屬性較強，操作簡單快捷的特點，可用于總黃酮的測定，是總化合物測定方法的首選方法。化橘紅中的總黃酮主要以柚皮苷的形式存在，其含有多個酚羥基，受光照射或暴露在空氣中，容易變色，采用紫外分光光度法測定化橘紅中總黃酮含量可以避免檢測結果不準確的現象，且該測定方法操作簡單方便[7,14-16]，在測定化橘紅類產品時能發揮很好的作用。

5 結 論

本研究以化橘紅為原料，采用均勻設計優化了化橘紅中總黃酮的提取工藝，選擇了提取溶劑、提取體積、提取時間進行考察，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數100%，液料比1:100，提取時間70 min，采用水浴加熱回流提取法。在此條件下，黃酮的平均提取率為15.92%。該提取方式適用于大多數實驗室條件，不用石油醚進行提取化橘紅總黃酮的最佳提取工藝。將化橘紅提取液濃縮后可用于制備化橘紅顆粒、化橘紅泡騰片等，為化橘紅的資源利用提供了參考。