膽堿色氨酸離子液體對杜仲葉黃酮的提取*

任海琴，王潤平

(黔南民族師范學院化學化工學院，貴州省普通高校民族藥用植物資源開發工程研究中心，貴州 都勻 558000)

離子液體是一種熔融鹽，其中一些在室溫或接近室溫下以液體形式存在，可以在純溶液和水溶液中充當各種化合物的增溶溶劑[1]，因此已應用于來自生物物質中的活性成分和附加值化合物的提取[2-5]。杜仲是杜仲科植物多年生落葉喬木[6]，分布廣泛，主要集中在廣西、張家界、四川、貴州等地。杜仲中含有黃酮類、環烯醚萜類、杜仲膠、木脂素類及苯丙素類等多種具有生物活性的成分[7]。現代研究表明，杜仲葉含具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗瘤性、降低血脂、調節免疫等多種作用的黃酮[8]。因此，本文制備了一種新型綠色溶劑-膽堿色氨酸離子液體提取杜仲葉黃酮。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

杜仲葉(貴州本地采摘)；蘆丁標準品；色譜級甲醇；氯化717陰離子交換樹脂。空氣恒溫振蕩器，培英THZ-D；紫外可見分光光度計，北京普析TU-1901；超純水機，艾科浦AWL-0501-M；真空干燥箱，上海精宏DZF-6050；旋轉蒸發儀，步琪R-100等。

1.2 膽堿色氨酸離子液體的制備

首先用飽和NaCl溶液浸泡717陰離子樹脂，后用去離子水清洗干凈。用4% HCl溶液浸泡樹脂4 h，后用去離子水洗至中性；接著用4% NaOH溶液浸泡4 h，去離子水洗至中性后，重復以上步驟2～3次。將處理好的樹脂裝進柱子，將4% NaOH溶液倒入柱子進行陰離子交換，用5%AgNO3-HNO3溶液檢測柱下濾液是否含有氯離子。若無氯離子，則用蒸餾水洗至中性，然后向柱中樹脂內加入一定量的氯化膽堿進行交換，并收集交換出的氫氧膽堿。

圖1 膽堿色氨酸離子液體的合成路線Fig.1 Synthetic route of choline tryptophan ionic liquid

稱取一定量的色氨酸加入圓底燒瓶里，加入適量的水；按照摩爾比氫氧膽堿:色氨酸=1:1.1用分液漏斗緩慢滴加氫氧膽堿溶液，在室溫下借助磁力攪拌反應12 h，具體合成路線見圖1。用旋轉蒸發儀將水旋干后，加入適量的甲醇與乙腈的混合溶劑，使未反應完的色氨酸沉淀出來，濾去沉淀，將其旋干后，利用真空干燥箱將其烘干，重復操作三次，得到較純凈的膽堿色氨酸離子液體，并用核磁共振氫譜進行表征。

1.3 膽堿色氨酸離子液體對杜仲葉組織的滲透

稱取少量的杜仲葉粉末分別加入裝有40%的色氨酸離子液體和純水的試管中，在25 ℃恒溫搖床中提取1 h后，離心，將離心液和杜仲葉渣分離后，把提取后的杜仲葉渣置于45 ℃鼓風干燥箱中烘干粉粹并用掃描電鏡進行檢測。

1.4 膽堿色氨酸離子液體對杜仲中黃酮的提取

用一定濃度的膽堿色氨酸離子液體提取一定量的杜仲葉粉末，在一定溫度下震蕩提取一定時間，離心后棄掉固體葉渣收集離心液。單因素實驗：

(1)稱取質量為0.3 g左右的杜仲葉粉末分別放入5組小燒杯，按照提取體系離子液體含量30%分別加入膽堿色氨酸離子液體和水，分別在25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃下震蕩提取90 min。

(2)稱取5組質量分別為0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g、1.1 g左右的杜仲葉粉末放入小燒杯，按照提取體系離子液體含量30%分別加入膽堿色氨酸離子液體和水，25 ℃下震蕩提取90 min。

(3)稱取質量為0.3 g左右的杜仲葉粉末分別放入5組小燒杯，按照提取體系離子液體含量30%分別加入膽堿色氨酸離子液體和水，在25 ℃下分別震蕩提取150 min、120 min、90 min、60 min、30 min。

1.5 總黃酮含量的紫外測定

測定方法按照文獻的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[9]，精確吸取標準對照品1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別置于25 mL的容量瓶中，向每個容量瓶中分別加入1 mL 5%的亞硝酸鈉，過6 min后加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，再過6 min后加入10 mL 4%的氫氧化鈉溶液，用40%的甲醇定容，混勻，放置15 min后在λ=510 nm處測量其吸光度A制作總黃酮的標準曲線。用移液槍分別吸取上述提取液離心后的上清液100 μL分別置于25 mL的容量瓶中，按上述方法測定各上清液的吸光度A，并用以公式(1)計算其提取率Y：

(1)

式中：C、V分別表示離心后上清液的濃度和體積， M為所稱杜仲葉粉末的質量。

2 結果與討論

首先，膽堿色氨酸離子液體恒溫振蕩浸提過的杜仲葉組織的電鏡掃描觀測結果顯示，顯堿性的膽堿色氨酸離子液體溶液能較好地破壞杜仲葉細胞壁結構，使其中的溶質分子較易滲出，從而易于后面杜仲葉總黃酮的提取。同時，基于膽堿色氨酸離子液體的恒溫振蕩浸提杜仲葉單因素實驗得出提取溫度、杜仲葉粉末質量和提取時間顯著影響提取液離心后上清液的總黃酮濃度和杜仲葉總黃酮產率Y。

2.1 膽堿色氨酸離子液體對杜仲葉組織的滲透

圖2 膽堿色氨酸離子液體浸提后的杜仲葉組織 電鏡掃描結果Fig.2 Scanning results of eucommia leaf tissue extracted with choline tryptophan ionic liquid

根據圖2的電鏡掃描觀察結果可以看出，堿性的膽堿色氨酸離子液體溶液作為溶劑能有效地破壞杜仲葉組織，并滲透進入組織內部，從而使杜仲葉中的活性成分溶出，達到提取總黃酮的目的。

2.2 提取溫度的影響

表1 相同提取體系下提取溫度對杜仲葉總黃酮提取產率的影響Table 1 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids in Eucommia ulmoides leaves under the same extraction system

在總體系離子液體含量30%、杜仲葉粉末質量0.3 g左右、振蕩提取90 min的提取體系下，隨著提取溫度的增加，離心后收集的上清液體積也開始逐步增加，45 ℃時到達最大值6.8 mL，此后開始逐漸降低；隨著溫度的上升，上清液總黃酮濃度和總黃酮提取產率也基本保持相同的趨勢，在55 ℃時黃酮的提取率最高，為2.57%，上清液總黃酮濃度為1.2465 mg/mL，當溫度繼續增加，上清液總黃酮濃度和杜仲葉總黃酮的提取產率降低，這可能是溫度過高，堿性的膽堿色氨酸離子液體溶液加速杜仲葉組織中的半纖維素、木質素、纖維素等的溶出，導致收集的上清液體積減少和相關活性物質的濃度降低，從而導致杜仲葉總黃酮的提取率降低。

2.3 杜仲葉粉末質量的影響

在總體系離子液體含量30%、25 ℃振蕩提取90 min的提取體系下，隨著提取原料杜仲葉粉末的增加，離心后的上清液總黃酮濃度和總黃酮產率都分別在上升，但收集的上清液體積卻在逐步降低，這是因為隨著杜仲葉粉末質量的增加，提取體系的粘度增加，離心時導致杜仲葉殘渣中滯留的溶液增多，從而使收集的上清液體積減少。

表2 相同提取體系下杜仲葉粉末質量對杜仲葉總黃酮提取率的影響Table 2 Effect of Eucommia ulmoides leaves powder content on the yield of total flavonoids under the same extraction system

2.4 提取時間的影響

表3 相同提取體系下提取時間對杜仲葉總黃酮提取率的影響Table 3 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids in Eucommia ulmoides leaves under the same extraction system

在總體系離子液體含量30%、杜仲葉粉末質量0.3 g左右、25 ℃振蕩提取的提取體系下，隨著提取時間的延長，提取液離心后上清液總黃酮濃度和杜仲葉總黃酮產率都逐步增加，但120 min后變化不是太明顯，且收集的上清液體積雖然有增加的趨勢，但也不是很顯著。

3 結 論

顯堿性的膽堿色氨酸離子液體溶液能較好地破壞杜仲葉細胞壁結構，使其中的溶質分子較易滲出，從而易于杜仲葉總黃酮的提取。同時基于單因素提取實驗得出，提取溫度、杜仲葉粉末量、提取時間會顯著影響膽堿色氨酸離子液體溶液提取杜仲葉總黃酮產率；根據單因素最佳組合驗證實驗結果，在總體系離子液體含量30%，杜仲葉粉末量1 g左右55 ℃振蕩提取90 min時的總黃酮提取產率最佳可達3.26%。