HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定黃芪中兩種皂苷成分及大孔樹(shù)脂純化工藝研究*

王文宇，方麗波，付恩桃，吳 丹

(合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 合肥 238000)

黃芪，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。現(xiàn)代檢測(cè)分析黃芪所含主要的化學(xué)成分為黃芪多糖類、皂苷類、黃酮類化合物等[1]，是補(bǔ)氣要藥，具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗氧化[2]，抗病毒、抗腫瘤、降血糖和雙向調(diào)節(jié)血壓及多種臟器保護(hù)[3]等多種作用。皂苷類化合物是黃芪中重要的有效成分之一，隨著分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)先后從膜莢黃芪和蒙古黃芪及其同屬近緣植物中分離出40多種三萜皂苷類化合物[4]，主要有黃芪皂苷I-Ⅷ、乙酰基黃芪皂苷、異黃芪皂苷I-Ⅳ、大豆皂苷等四大類。黃芪皂苷Ⅳ(亦稱黃芪甲苷)是黃芪總皂苷的有效成分，含量最高，因此黃芪甲苷常作為黃芪藥材的定性定量指標(biāo)[5]。

目前針對(duì)于黃芪皂苷成分的提取方法很多，但多較為繁雜且效率較低。此外，對(duì)黃芪進(jìn)行質(zhì)量控制也多選擇以某一個(gè)化合物為基礎(chǔ)，用內(nèi)標(biāo)法對(duì)多個(gè)皂苷成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定的方法較少。實(shí)驗(yàn)選取黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ作為黃芪藥材的定性定量指標(biāo)并選用人參皂苷Rb2作為內(nèi)標(biāo)物，利用大孔樹(shù)脂吸附能力強(qiáng)、除雜能力好及富集效果顯著的優(yōu)勢(shì)對(duì)黃芪中的皂苷類成分進(jìn)行富集純化，再選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)對(duì)兩種皂苷成分進(jìn)行分析。為黃芪的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供可靠的提取純化工藝方案以及分析檢測(cè)手段，為黃芪的質(zhì)量控制提供新的途徑，為黃芪皂苷類成分的提取提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Waters 2696高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;Waters 2434蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器,合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；FA2204B電子分析天平,上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 藥品、試劑與耗材

黃芪(產(chǎn)自甘肅定西)，岷縣和泰中藥材有限公司；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：AG42117A，純度≥99%),合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；黃芪皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：AS32106A，純度≥99%),合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；人參皂苷Rb2標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：GR121330，純度≥99%),合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；Waters Symmetry C18色譜柱,美國(guó)Waters公司；AB-8大孔吸附樹(shù)脂,東鴻化工有限公司；XDA-1大孔吸附樹(shù)脂,和成新材料有限責(zé)任公司；XDA-5大孔吸附樹(shù)脂,和成新材料有限責(zé)任公司；乙腈(色譜純),美國(guó)TEDIA公司；冰醋酸(色譜純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫為28 ℃，流動(dòng)相為0.2%冰醋酸(A)-乙腈(B)，設(shè)置梯度洗脫程序，詳見(jiàn)表1，進(jìn)樣量10 μL。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器設(shè)置：漂移管溫度為65 ℃，供氣壓力172.38 Pa。理論板數(shù)按內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rb2計(jì)，應(yīng)不低于5000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 The gradient of mobile phase

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取29.35 mg黃芪甲苷對(duì)照品及20.56 mg黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚謩e置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得黃芪甲苷及黃芪皂苷Ⅱ混合對(duì)照品溶液，濃度分別為0.5870 mg/mL及0.4112 mg/mL；精密稱取50.46 mg人參皂苷Rb2，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得內(nèi)標(biāo)物溶液，濃度為0.5046 mg/mL；分別精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，置10 mL量瓶中，精密量取內(nèi)標(biāo)物溶液各1.0 mL，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

將黃芪置60 ℃烘箱干燥24 h，將其打粉過(guò)篩，稱量粉末5 g，放入500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL 70%乙醇，浸泡12 h后，再次加熱，回流提取3次，每次提取時(shí)間為1 h，過(guò)濾，將過(guò)濾溶液蒸干，加入10 mL純化水使殘?jiān)芙猓瑢⑷芤恨D(zhuǎn)移到分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取20 mL，萃取完成后將非乙酸乙酯層丟棄，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，濃縮干燥，加甲醇定容到10 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別精密吸取上述溶液及人參皂苷Rb2內(nèi)標(biāo)物溶液各1.0 mL，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別吸取甲醇溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液，按照給定的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液色譜圖中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、人參皂苷Rb2的保留時(shí)間分別為19.5 min、22.9 min、16.1 min左右。供試品溶液相同保留時(shí)間處也可檢測(cè)到三種物質(zhì)的色譜峰，分離度良好且在出峰位置無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取以上系列對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，記錄峰面積，以黃芪甲苷或黃芪皂苷Ⅱ進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)，內(nèi)標(biāo)物與黃芪甲苷或黃芪皂苷Ⅱ峰面積比值的自然對(duì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得黃芪甲苷回歸方程為Y=-1.1367-0.3261，R2=0.9994；黃芪皂苷Ⅱ回歸方程為Y=-1.2452-0.4637，R2=0.9997。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.2935～2.9350 μg，黃芪皂苷Ⅱ進(jìn)樣量在0.2056～2.0560 μg，兩者的進(jìn)樣量自然對(duì)數(shù)值與人參皂苷Rb2和兩者峰面積比值自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下未加內(nèi)標(biāo)物的混合對(duì)照品溶液0.5，3.0，6.0，分別置10 mL量瓶中，再精密加入1.0 mL內(nèi)標(biāo)物溶液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得低、中、高三個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按上述“2.1”項(xiàng)的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各濃度，計(jì)算重復(fù)性。結(jié)果顯示，黃芪甲苷及黃芪皂苷Ⅱ的RSD分別為1.53%和0.89%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別制備對(duì)照品和供試品溶液，在0 h、4 h、8 h、12 h及24 h分別進(jìn)樣分析，測(cè)黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ及人參皂苷Rb2的峰面積，考察對(duì)照品和供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，對(duì)照品和供試品溶液在24h內(nèi)人參皂苷Rb2與黃芪甲苷或黃芪皂苷Ⅱ峰面積比值基本穩(wěn)定，人參皂苷Rb2與黃芪甲苷峰面積比值在對(duì)照品和供試品中的RSD分別為1.46%、2.12%，人參皂苷Rb2與黃芪皂苷Ⅱ峰面積比值在對(duì)照品和供試品中的RSD分別為0.97%、1.23%。

2.4 大孔樹(shù)脂富集純化黃芪皂苷

2.4.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理和裝柱

分別稱取AB-8、XDA-1及XDA-5大孔吸附樹(shù)脂各3份，每份5 g，加入7～8倍量95%乙醇浸泡24 h，抽濾，傾去上浮物后以5 mL/h的流速濕法裝柱(柱高25 cm)，接著用95%乙醇淋洗，直至流出的溶液與3倍水混合后未見(jiàn)白色渾濁，停止乙醇淋洗，最后以純化水洗凈至無(wú)醇味，浸泡備用。

2.4.2 黃芪提取液

取“2.2.2”項(xiàng)下干燥的黃芪粉末20 g，以70%乙醇200 mL加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，水浴濃縮浸膏至無(wú)醇味，加入蒸餾水?dāng)嚢璨⒍ㄈ葜?00 mL，冷卻后抽濾得澄清液，即得。

2.4.3 不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂吸附容量的確定

取“2.4.2”項(xiàng)下的黃芪提取液20 mL上柱，預(yù)吸附1 h，流出液重吸附1次，每20 mL收集一份，不同型號(hào)得大孔樹(shù)脂各平行3份。將樣品轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中并揮干，加甲醇定容到100 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別精密吸取上述溶液及人參皂苷Rb2內(nèi)標(biāo)物溶液各1.0 mL，搖勻，再按HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷及黃芪皂苷Ⅱ的總量，計(jì)算吸附容量，吸附容量=(上住液中兩種皂苷總量-過(guò)柱液中兩種皂苷總量)/干樹(shù)脂含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吸附容量Table 2 Adsorptive capacity

由表2可見(jiàn)，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪兩種皂苷的富集作用更加明顯，故選擇該型號(hào)樹(shù)脂進(jìn)行吸附。

2.4.4 洗脫溶媒的選擇

稱取AB-8型大孔樹(shù)脂20 g，按照“2.4.1”項(xiàng)進(jìn)行預(yù)處理和裝柱。取黃芪提取液40 mL上柱，用200 mL蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再繼以30%乙醇、50%乙醇及70%乙醇各200 mL進(jìn)行洗脫。不同比例的乙醇洗脫液每50 mL收集1份，揮干并用甲醇定容至100 mL，過(guò)濾后加入內(nèi)標(biāo)物，再以之前擬定的色譜條件進(jìn)樣分析。以收集得洗脫液編號(hào)(X)為橫坐標(biāo)，以計(jì)算所得的兩種皂苷總量(Y)為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 梯度洗脫曲線Fig.2 Gradient elution curves

圖2的結(jié)果顯示，30%乙醇和50%乙醇對(duì)黃芪中兩種皂苷的洗脫能力均較強(qiáng)，兩種皂苷更多的集中在50%乙醇洗脫液中，占比達(dá)65.86%。而70%乙醇洗脫液中，兩種皂苷總量?jī)H為全部洗脫液的8.50%，占比很少。故確定洗脫條件為：蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，繼用50%乙醇洗脫黃芪中的皂苷成分，收集50%乙醇洗脫部分。

2.4.5 洗脫溶媒用量

選取“2.4.4”項(xiàng)下的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行本項(xiàng)試驗(yàn)。吸取黃芪提取液40 mL上柱，蒸餾水的用量分別為100 mL(條件1)、150 mL(條件2)、200 mL(條件3)，再用200 mL的50%乙醇依次洗脫，洗脫液每50 mL收集一次，揮干過(guò)濾后按色譜條件測(cè)定乙醇洗脫液中的兩種皂苷總量。結(jié)果三個(gè)條件下計(jì)算的兩種皂苷總量(20 g生藥中)分別為40.85 mg(條件1)、38.79 mg(條件2)、37.42 mg(條件3)，三者比較無(wú)顯著性差異，條件1提取所得最高。分四段收集的乙醇洗脫液中，前100 mL中兩種皂苷成分的洗脫率在83.76%左右，已收集大部分。故確定本次優(yōu)化的最終條件為：吸取黃芪提取液40 mL上柱，100 mL蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，繼用100 mL 50%乙醇洗脫黃芪中的皂苷成分，收集50%乙醇洗脫部分。

3 結(jié) 論

3.1 檢測(cè)器及流動(dòng)相條件選擇

黃芪中的主要成分包括多糖、黃酮和皂苷，黃芪甲苷及黃芪皂苷Ⅱ在紫外末端只有弱吸收，故采用傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器無(wú)法精確測(cè)定兩種皂苷成分的含量。ELSD是一種通用型檢測(cè)器，尤其適合于幾乎沒(méi)有紫外吸收的皂苷類化合物的測(cè)定，故本文選取該檢測(cè)器對(duì)黃芪甲苷及黃芪皂苷Ⅱ進(jìn)行含量測(cè)定。

在實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)大量文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪皂苷類成分時(shí)，選擇的流動(dòng)相包括甲醇-水、乙腈-水和乙腈-酸水溶液三種洗脫系統(tǒng)，經(jīng)多次考察驗(yàn)證，乙腈-酸水溶液系統(tǒng)的基線噪音肖，色譜峰的分離度和拖尾均由于其他兩種系統(tǒng)。為避免酸性對(duì)色譜柱的損害，保護(hù)色譜柱，需盡量降低酸的濃度，但過(guò)低會(huì)影響色譜峰靈敏度。我們選擇0.3%、0.2%及0.1%的冰醋酸及甲酸溶液進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用0.2%的冰醋酸溶液作為流動(dòng)相可在較低的酸濃度下獲得不錯(cuò)的色譜峰靈敏度，故本實(shí)驗(yàn)最終選取0.2%冰醋酸-乙腈作為流動(dòng)相。

3.2 人參皂苷Rb2作為內(nèi)標(biāo)物

通過(guò)觀察黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷類成分與兩者的結(jié)構(gòu)類似，且黃芪中不含油人參皂苷類成分。對(duì)比觀察人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rb3作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)，供試品中各色譜峰的分離度，結(jié)果人參皂苷Rb2與黃芪中兩種皂苷成分的分離度良好，出峰位置無(wú)干擾，且出峰時(shí)間較為接近，是理想的內(nèi)標(biāo)物。