不同傅里葉變換紅外光譜法研究土壤光譜特征的比較與應用

張明洋, 朱兆龍, 李好好, 馮程龍, 安韶山,2

(1.西北農林科技大學 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農業國家重點實驗室, 陜西 楊凌 712100; 2.中國科學院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農業國家重點實驗室, 陜西 楊凌 712100; 3.西北農林科技大學 資源環境學院, 陜西 楊凌 712100)

土壤紅外光譜中不同特征吸收峰可用于表征土壤中某些有機物或礦物的官能團，并根據官能團特征吸收峰面積確定其中特定成分的含量[1]。因此，獲得質量較高的特征吸收峰紅外光譜圖對土壤性質的研究顯得尤為重要。近年來，傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR)技術在土壤表征和某些性質預測方面的應用越來越多。然而，傳統的土壤表征方法費時、昂貴，而FTIR技術整個測量過程簡單、快速且無破壞性[2]。在土壤學科研究中，由于絕大多數有機化合物和無機離子的基頻吸收帶出現在中紅外區[3]。基頻振動是紅外光譜中吸收最強的振動，所以該區最適于進行紅外光譜特征吸收峰分析，對未知物的結構及組成有重要識別作用[4]。因此，FTIR光譜技術受到大部分學者的青睞。Haberhauer等采用T-FTIR光譜研究分析了不同層次土壤有機質分解狀況，與森林土壤層相比，草地土壤層凋落物的輸入具有更高的均勻性[5]。Geyer等應用透射FTIR光譜結合偏最小二乘回歸(PLSR)方法預測土壤腐殖質的可能性[6]。Cuadros等利用透射FTIR光譜研究了高嶺石-蒙脫石的性質和演化機理[7]。

由于FTIR光譜在土壤學科研究的不斷深入，傳統透射FTIR光譜技術已不能滿足科研的實際要求，而FTIR光譜儀附件衰減全反射(Attenuated Total Reflection；ATR)和漫反射(Diffuse Reflection；DR)光譜的出現，解決了這一問題，并應用到土壤學領域中的分析研究。如ATR-FTIR光譜技術可用于獲得碳的形態結構特征[8]以及測定礦物樣品中多個固定波數的吸光度[9]；ATR-FTIR光譜還可以通過結合高斯曲線擬合來分析土壤有機質碳官能團變化特征[10]；DR-FTIR光譜可用于量化土壤光譜帶[11]、定量分析土壤有機質中腐殖酸的濃度和官能團的相對濃度[12]以及土壤中的無機離子[13]； DR-FTIR光譜還可以結合化學計量學方法，建立分析土壤成分的模型，快速對土壤腐殖層及礦質層土壤中的碳含量進行分析[14]。綜上，由于紅外光譜儀附件的出現，傅里葉變換紅外光譜測試平臺功能不斷擴大，性能逐漸提高，也使FTIR光譜技術在土壤分析中得到更加廣泛的應用。

雖然目前T-FTIR，DR-FTIR和ATR-FTIR這3種光譜技術在土壤中有著較多的研究，但是由于被測的樣品本身存在差異，不同光譜技術的優劣以及適用范圍尚不清楚。因此本試驗用純度較高的有機物與成分復雜的土壤為試驗材料，對3種不同FTIR光譜技術的測定結果進行對比分析，為光譜技術在土壤學領域中的應用提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

本試驗所用儀器為Thermo Scientific NicoletiS50傅立葉變換紅外光譜儀，包括透射平臺、衰減全反射平臺和漫反射平臺。檢測范圍4 000～400 cm-1，掃描次數32次，分辨率4 cm-1，測定時選擇自動大氣背景扣除，每次測試完成后用酒精棉進行清潔。

1.2 試驗材料

于2020年11月，在陜西省富縣任家臺子午嶺林區內采集遼東櫟林地和草地的0—20 cm的原狀土，帶回實驗室自然風干后挑出根系、石塊、蟲體等雜物后研磨備用。有機物 (苯甲酸、硬脂酸)為分析純，于常溫下保存備用。對混合土壤(遼東櫟、草地)測定選取9個不同比例(1∶0，9∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶9，0∶1)。

1.3 試驗方法

1.3.1 傅里葉變換紅外透射光譜(T-FTIR) 透射法是采用溴化鉀壓片法對樣品紅外光譜測定，對于已知官能團有機物(苯甲酸、硬脂酸)的測定，將光譜純的溴化鉀在120℃下烘干4 h，有機物在40℃烘箱內烘干10 h至恒重，按照1∶150比例放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證有機物與溴化鉀混合均勻，充分研磨后的有機物轉移到壓片裝置并填充均勻，上壓片機加壓20 MPa壓片約30 s，壓片的厚度大約為1 mm左右并呈乳白色不透明狀且有機物均勻的分布在溴化鉀內部。

土壤樣品用瑪瑙研磨儀磨過0.053 mm分樣篩，將光譜純的溴化鉀在120℃下烘干4 h，土壤樣品60℃烘干16 h至恒重，并按照1∶100比例混合并放置于瑪瑙研缽中，在紅外燈下充分研磨5 min以保證土壤樣品與溴化鉀混合均勻，研磨后的土壤樣品轉移到壓片裝置并填充均勻，在壓片機加壓20 MPa壓片約30 s，壓片的成品厚度大約為1 mm左右，呈半透明狀且土壤樣品均勻的分布在溴化鉀內部。

1.3.2 傅里葉變換紅外漫反射光譜(DR-FTIR) 對于已知官能團有機物(苯甲酸、硬脂酸)的單一測定，有機物在40℃烘箱內烘干10 h，取適量的有機物，放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證有機物粒徑均勻，充分研磨后的有機物在不使用任何壓力的條件下填充在樣品凹槽中，樣品表面用鋒利的刮刀使之光滑平整。

土壤樣品用瑪瑙研磨儀磨過0.053 mm分樣篩，將土壤樣品60℃烘干16 h至恒重，稱取適量的土壤樣品，放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證土壤樣品粒徑均勻。在不使用任何壓力的條件下填充在樣品凹槽中，樣品表面用鋒利的刮刀使之光滑平整。

對于有機物與溴化鉀混合不同比例進行測定，需將光譜純的溴化鉀在120℃下烘干4 h，有機物在40℃烘箱內烘干10 h，按照1∶150比例放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證有機物與溴化鉀混合均勻，充分研磨后的有機物在不使用任何壓力的條件下填充在樣品凹槽中，樣品表面用鋒利的刮刀使之光滑平整。

1.3.3 傅里葉變換紅外衰減全反射光譜(ATR-FTIR)對于已知官能團有機物(苯甲酸、硬脂酸)的測定，有機物在40℃烘箱內烘干10 h，取適量的有機物，放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證有機物呈粉末狀且粒徑均勻。

測試前將土壤樣品用瑪瑙研磨儀磨過0.053 mm分樣篩，將土壤樣品60℃烘干16 h至恒重，取適量的土壤樣品，放置于瑪瑙研缽中，并在紅外燈下充分研磨5 min以保證土壤樣品粒徑均勻。

1.4 數據處理與分析

采用Omnic9.9軟件對紅外光譜進行基線校正并另存為CSV文本，使用Excel 2019整理數據、R語言進行數據分析，用Origin 2021制作結果圖。

2 結果與分析

2.1 不同紅外光譜技術測定有機物樣品的對比分析

2.1.1 衰減全反射光譜(ATR-FTIR) 由圖1可知，苯甲酸和硬脂酸在ATR平臺上測得的譜圖呈現出較好的特征吸收峰，可對光譜圖進行鑒別與分析。苯甲酸譜圖中，3 069.28 cm-1是苯環中次甲基-CH的伸縮振動吸收峰，2 996.68 cm-1是羧酸中羥基-OH伸縮振動吸收峰，1 682.43 cm-1是羧酸中羰基-C=O的伸縮振動吸收峰，1 600.45，1 582.12，1 495.88，1 454.10 cm-1是苯環C=C骨架伸縮振動吸收峰，1 420.35 cm-1，932.43 cm-1分別是羧酸中羥基-OH面內和面外彎曲振動吸收峰，1 289.80 cm-1是 C-O鍵伸縮振動吸收峰，705.99和 683.48 cm-1是單取代苯環中次甲基-CH變形振動的特征吸收峰。在硬脂酸譜圖中，2 954.67，1 373.91 cm-1分別是甲基-CH3伸縮振和彎曲振動吸收峰，2 914.53，2 847.41 cm-1分別是亞甲基-CH2的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰，1 697.64 cm-1為羧酸中羰基-C=O鍵伸縮振動吸收峰，1 471.34 cm-1為亞甲基-CH2對稱彎曲振動吸收峰，1 098.41 cm-1為C-O鍵伸縮振動吸收峰，1 410.45，932.43 cm-1分別為羧酸中羥基-OH的面內和面外彎曲振動吸收峰。

圖1 苯甲酸和硬脂酸ATR-FTIR譜圖

2.1.2 透射光譜(T-FTIR) 由圖2可知，用純度較高的有機物樣品可以制備成錠片進行上機測試，但譜圖中出現平頭峰，沒有有效特征吸收峰，無法對光譜圖進行鑒別與分析。

圖2 苯甲酸與硬脂酸T-FTIR譜圖

由圖3可知，用KBr稀釋過的苯甲酸和硬脂酸的譜圖呈現出較好的特征吸收峰，可對光譜圖進行鑒別與分析。苯甲酸譜圖中，3 071.97 cm-1是苯環中次甲基-CH的伸縮振動吸收峰，3 000.83 cm-1是羧酸中羥基-OH伸縮振動吸收峰，1 686.08 cm-1是羧酸中羰基-C=O的伸縮振動吸收峰，1 601.96，1 583.64，1 496.46，1 454.10 cm-1是苯環C=C骨架伸縮振動吸收峰，1 424.96 cm-1，934.77 cm-1分別是羧酸中羥基-OH面內和面外彎曲振動吸收峰，1 292.87 cm-1是 C-O鍵伸縮振動吸收峰，705.99和 683.48 cm-1是單取代苯環中次甲基-CH變形振動的特征吸收峰。在硬脂酸譜圖中，2 955.83，1 375.19 cm-1分別是甲基-CH3伸縮振和彎曲振動吸收峰，2 917.21，2 849.12 cm-1分別是亞甲基-CH2的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰，1 686.08 cm-1為羧酸中羰基-C=O鍵伸縮振動吸收峰，1 471.34 cm-1為亞甲基-CH2對稱彎曲振動吸收峰，1 099.10 cm-1為C-O鍵伸縮振動吸收峰，1 410.83，933.21 cm-1分別為羧酸中羥基-OH的面內和面外彎曲振動吸收峰。

圖3 KBr稀釋后苯甲酸和硬脂酸T-FTIR譜圖

2.1.3 漫反射光譜(DR-FTIR) 由圖4可知，苯甲酸和硬脂酸在DR平臺上測得的譜圖呈現出較好的特征吸收峰，可對光譜圖進行鑒別與分析。苯甲酸譜圖中，3 073.21 cm-1是苯環中次甲基-CH的伸縮振動吸收峰， 3 035.66 cm-1是羧酸中羥基-OH伸縮振動吸收峰，1 716.29 cm-1是羧酸中羰基-C=O的伸縮振動吸收峰，1 603.59，1 584.38，1 496.57，1 455.67 cm-1是苯環C=C骨架伸縮振吸收峰，1 431.74，947.94 cm-1分別是羧酸中羥基-OH面內和面外彎曲振動吸收峰，1 303.82 cm-1是 C-O鍵伸縮振動吸收峰，719.14和 685.06 cm-1是單取代苯環中次甲基-CH變形振動的特征吸收峰。在硬脂酸譜圖中，2 958.57，1 376.40 cm-1分別是甲基-CH3伸縮振和彎曲振動吸收峰，2 917.21，2 857.70 cm-1分別是亞甲基-CH2的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰，1 717.59 cm-1為羧酸中羰基-C=O鍵伸縮振動吸收峰，1 470.11 cm-1為亞甲基-CH2對稱彎曲振動吸收峰，1 098.79 cm-1為C-O鍵伸縮振動吸收峰，1 410.79，941.74 cm-1分別為羧酸中羥基-OH的面內和面外彎曲振動吸收峰。

圖4 苯甲酸和硬脂酸DR-FTIR譜圖

2.2 土壤樣品在不同紅外光譜技術中的對比分析

2.2.1 衰減全反射光譜(ATR-FTIR) 由圖5可知，在ATR平臺上對遼東櫟土壤樣品測得的譜圖僅有兩個有效特征吸收峰，分別為1 455.38 cm-1處甲基-CH3變形振動和1 007.94 cm-1處醚鍵C-O-C特征吸收峰。

圖5 遼東櫟土壤ATR-FTIR譜圖

2.2.2 透射光譜(T-FTIR) 由于土壤本身的特性無法壓片，只能與KBr粉末混合后制備成錠片上機測試。由圖6可知，遼東櫟的土壤譜圖呈現出較好的特征吸收峰，可以對光譜圖的進行鑒別與分析。3 619.00，3 550.98 cm-1是醇酚類化合物中羥基-OH特征吸收峰，2 971.90，2 850.24 cm-1為脂肪類化合物中甲基-CH3特征吸收峰，1 660.20，1 543.20，1 432.67 cm-1為芳香類化合物中苯環C=C骨架特征吸收峰，1 031.03 cm-1為多糖類化合物中醚鍵C-O-C特征吸收峰。

圖6 遼東櫟土壤與KBr混合T-FTIR譜圖

2.2.3 漫反射光譜(DR-FTIR) 由圖7可知，遼東櫟土壤的譜圖呈現出較好的特征吸收峰，可以對光譜圖的進行鑒別與分析。3 620.69，3 410.73 cm-1是醇酚類化合物中羥基-OH特征收峰，2 930.23 cm-1為脂肪類化合物中甲基-CH3特征吸收峰，1 992.13，1 867.86，1 794.95 cm-1為石英的泛頻峰，1 621.70，1 454.22 cm-1為芳香類化合物中苯環C=C骨架特征吸收峰，982.42 cm-1糖類化合物中醚鍵C-O-C特征吸收峰。

圖7 遼東櫟土壤DR-FTIR譜圖

2.3 土壤混合樣品在T-FTIR與DR-FTIR技術中定量分析

通過比較土壤官能團在3種不同傅里葉變換技術下特征吸收峰的差異，發現T-FTIR以及DR-FTIR的表征效果較好，因此采用這兩種光譜技術進行進一步的定量分析。以遼東櫟土壤樣品作為參照與草地的土壤樣品按不同比例混合，分別用T-FTIR與DR-FTIR測試，分析每個測試樣品譜圖中不同波段的特征吸收峰面積差異后，選取波數2 980～2 880 cm-1吸收峰面積作為參照。由圖8可知，隨著混合樣品中草地土壤質量分數的逐漸增大，波段1 470～1 440 cm-1與2 980～2 880 cm-1的吸收峰面積的比值隨之升高。線性擬合T-FTIR光譜中R2=0.70，DR-FTIR光譜中R2=0.88。

圖8 兩種光譜測試下的線性擬合圖

3 討 論

3.1 有機物與土壤樣品在ATR-FTIR光譜技術中的差異

圖1中苯甲酸與硬脂酸樣品均出現本身具有的特征吸收峰，表明ATR-FTIR光譜技術可以得到樣品中官能團或者基團的特征吸收峰。圖5中遼東櫟土壤樣品僅在1 455.38 cm-1，1 007.94 cm-1處出現甲基-CH3和醚鍵C-O-C兩個特征吸收峰。這一方面是由ATR-FTIR光譜工作原理導致的。當紅外光束在晶體內的入射角大于臨界角時會發生全反射。這時紅外光束并未穿越晶體表面進入待測樣品，而是在晶體的外邊面附近產生隱失波，當樣品與晶體外表面接觸時，在反射點隱失波會穿入樣品。從隱失波衰減的能量可得到樣品的吸收信息，檢測器經轉換與變換得到樣品的ATR-FTIR光譜[15]。隱失波的穿透深度受光束波長的影響。穿透深度與光束的波長呈正比，不同波長的紅外光透入樣品的深度不同，在長波處吸收峰因透入深度大使峰強增大，在短波處吸收峰較弱[16]。所以ATR-FTIR光譜在不同波數區間靈敏度也不相同，這就是在短波區域靈敏度低的原因。另一方面是由于土壤本身的異質性，使其折射率較低，從而影響吸收峰的強弱。相比于土壤樣品，有機物樣品本身的折射率較高。因此， ATR-FTIR光譜適用于純度較高的樣品，對組成復雜的土壤樣品不宜使用。

3.2 有機物與土壤樣品在T-FTIR光譜技術中的差異

在T-FTIR光譜試驗中，把有機物(苯甲酸、硬脂酸)制備成錠片測試后，并沒有得到有效特征吸收峰譜圖，而是在譜圖中出現平頭峰(圖2)，其原因是測試樣品含量過多與濃度過高使得特定波段紅外光被全吸收。在T-FTIR測試過程中，樣品被放置在紅外光束的路徑上，當紅外光源照射樣品后，樣品中的分子會吸收某些特定波長的光，使樣品中的分子被激發到一個更高的能量狀態，就會發生紅外光的吸收，沒有被吸收的光會到達檢測器，經轉換與變換得到樣品的T-FTIR光譜[17]。即使有機物所用含量達到制備錠片的最小值時，大部分紅外光線也無法穿過樣品到達檢測器。由圖3可知，當用KBr與有機物樣品150∶1混合稀釋后，樣品含量減少同時濃度降低，使其具有更好的透光性，由此可以得到清晰具有特征吸收峰的譜圖。因此，根據T-FTIR光譜的工作原理可知，制備的樣品必須濃度較低且錠片厚度較薄，才能有足夠的光線到達檢測器。

對于土壤而言，土壤是復雜多組分混合物質，其本身不具有壓制成片的特性，需使用KBr與土壤樣品按100∶1混合后，研磨充分后制備成透光性較好的錠片。由圖6可知，遼東櫟土壤樣品測試譜圖中具有明顯的特征吸收峰。因此，T-FTIR光譜對純度較高和成分復雜土壤樣品都可以進行測試，但制備樣品工藝較復雜，需先用KBr與樣品混合稀釋，再將混合后的樣品放入模具壓成錠片方可上機測試。

3.3 有機物與土壤樣品在DR-FTIR光譜技術中的差異

在DR-FTIR光譜測試中，無論是純度較高的有機物還是成分復雜的土壤樣品均能測得有效特征吸收峰(圖4，圖7)。這是因為DR-FTIR中紅外光照射到粉末樣品表層上時，紅外光與樣品的作用有兩種。一部分光在樣品顆粒表面反射，由于反射光束沒有進入樣品顆粒內部，所以不負載樣品的任何信息。另一部分光會射入樣品內部，光束在樣品內部經過多次的透射、折射和反射后，從粉末樣品的表面各個方向射出來組成漫反射光并匯集到檢測器上[18]。這部分漫反射光與樣品分子發生了相互作用，負載了樣品的結構和組成信息[19]。由此可知，DR-FTIR光譜技術對樣品的純度也無特殊要求，適用于成分較純的有機物與成分復雜的土壤樣品，且只需少量的樣品，無需制備樣品，。

此外，有機物和土壤在3種光譜中吸收峰的峰位并不相同，這是因為其測定原理的不同，對樣品作用的機理也就不同，從而導致相同官能團或基團的吸收峰的峰位發生偏移現象，但這并不影響對圖譜中特征吸收峰歸屬的比對與識別。

3.4 土壤混合樣品在T-FTIR與DR-FTIR技術中定量分析

紅外光譜定量分析是根據郎伯-比爾定律，在透射光譜中吸光度與樣品組分百分含量呈正比，也與樣品厚度呈正比[20]。而漫反射光譜的吸光度與樣品的組分含量不符合郎伯-比爾定律，是因為存在鏡面反射光。須將吸光度轉化成K-M值以消除與波長有關的鏡面反射效應，轉換后的K-M值與樣品組分含量就可以呈線性比例關系進行定量分析[21]。由圖8可知，隨著草地土壤樣品的質量分數逐漸增大吸收峰面積的比率隨之升高，線性擬合結果DR-FTIR比T-FTIR光譜較好。原因是與DR-FTIR光譜技術相比， T-FTIR光譜技術在樣品制備過程中增加了KBr稀釋與壓片工藝，具體表現為樣品與KBr混合研磨過程中均勻性不能得到保證，在壓片過程中并不能保證每次重復的樣品厚度是一致的。透射光的強度受樣品的厚度及土壤樣品在KBr內部分布均勻情況的影響。因此，DR-FTIR光譜技術在獲取樣品組成和結構信息方面更為直接可靠。

4 結 論

ATR-FTIR光譜技術僅適用于純度較高的物質分析，對成分復雜的土壤樣品不適用。T-FTIR光譜技術可用于純度較高物質和成分復雜的土壤樣品，但需用KBr稀釋，且制備工藝較為復雜。DR-FTIR光譜技術可直接用于測定有機物和成分復雜的土壤樣品，無需經KBr稀釋，無需制備樣品，簡單易操作。在混合物定量分析中，DR-FTIR優于T-FTIR光譜技術，可用于大量土壤樣品的測定。