土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型的初步建立和驗證

王 洋 韓金成 于 天 梁喜植 薛書江

（延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133002）

0 引言

豬附紅細胞體是引起豬傳染性貧血的重要病原體之一，患病豬常表現(xiàn)出黃疸、貧血、發(fā)熱、生殖障礙等臨床癥狀。豬附紅細胞體對所有年齡段的豬都易感。急性感染的仔豬在臨床上常因溶血性貧血及低血糖發(fā)生急性死亡。在自然條件下，豬附紅細胞體的急性感染情況較少，多為慢性感染。慢性感染的豬存在輕度貧血、生長速度降低、生殖性能變差等癥狀，并對呼吸系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)的病原體有更高的易感性。另有研究表明，感染豬附紅細胞體會引起母豬生殖能力下降、發(fā)情期延長、乳汁分泌障礙等。豬附紅細胞體病多呈隱性感染，患病動物表現(xiàn)出的臨床癥狀不明顯，因此，該病常常被忽視，從而繼發(fā)感染其他病原體。繼發(fā)感染其他病原體的患病動物表現(xiàn)出復雜的臨床癥狀，給臨床診斷帶來挑戰(zhàn)，且預后效果不佳，易復發(fā)，直接影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟效益。因此，加強豬附紅細胞體病防治研究意義重大。

相關(guān)文獻資料表明，土霉素是治療豬附紅細胞體病比較理想的抗生素藥物。然而，養(yǎng)殖中濫用抗生素會帶來諸多危害，如使病原體產(chǎn)生耐藥性，引起動物免疫機能下降，甚至畜產(chǎn)品藥物殘留會威脅人類健康，因此，深入研究豬附紅細胞體病治療機制，找到豬附紅細胞體病無抗療法替代抗生素治療有重要意義。鑒于此，該試驗初步建立土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型，為豬附紅細胞體病抗生素替代藥物篩選和治療機制的深入研究提供助力。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗試劑和儀器

質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I）、血液DNA提取試劑盒（Gel Extraction Kit）和菌體DNA全基因提取試劑盒購自OMEGA公司。豬外周血淋巴細胞分離液購自索萊寶公司。肝素鋰抗凝管、血液生化試劑盤購自吉林省博愛樂康商貿(mào)有限公司。胰蛋白胨、酵母淀粉、NaCl、瓊脂粉、枸櫞酸鈉、檸檬酸和葡萄糖等均購自寶生物工程（大連）有限公司。鹽酸土霉素購自上海生工生物有限公司。

1.2 試驗動物與病原

清潔級4周齡昆明種小白鼠45只，體質(zhì)量在（23±1）g，購自延邊大學實驗動物中心；豬附紅細胞體陽性血液采自延邊州某豬場；豬附紅細胞體分離和純化參照華修國采用的方法。弗格森埃希菌JL菌株由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室分離鑒定及 保存。

1.3 試驗動物分組與處理

對小鼠進行尾尖采血，提取血液DNA，并進行PCR檢測。將PCR檢測鑒定無豬附紅細胞體感染的昆明種小白鼠平均分為3組，每組15只。A組為空白對照組，腹腔注射100 μL生理鹽水；B組為陰性對照組，腹腔注射100 μL濃度為1×10個/μL的豬附紅細胞體；C組為治療模型組，腹腔注射100 μL濃度為1×10個/μL的豬附紅細胞體，經(jīng)PCR檢測確認感染，在接種豬附紅細胞體第4天肌內(nèi)注射土霉素，連續(xù)注射3 d（時間分別為接種豬附紅細胞體第4天、第5天、第6天），注射劑量為0.016 65 mg/g。

1.4 小鼠一般性臨床癥狀觀察

從接種第1天開始計，觀察整個試驗周期（30 d）內(nèi)昆明種小白鼠的精神狀態(tài)及臨床癥狀。利用電子天平在接種第1天、第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天測量昆明種小白鼠的體質(zhì)量，記錄并計算每5 d昆明種小白鼠的平均日增質(zhì)量。利用電子體溫計在接種第1天、第4天、第7天、第10天、第13天、第16天、第19天、第21天、第24天、第27天、第30天測量昆明種小白鼠耳內(nèi)溫度，記錄整個試驗周期昆明種小白鼠體溫變化情況。對平均日增質(zhì)量和體溫變化進行統(tǒng)計學分析。

1.5 小鼠血液樣本的PCR檢測

對各組昆明種小白鼠在接種后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天、第28天、第30天進行尾尖采血。根據(jù)血液DNA提取試劑盒說明書提取DNA。采用于嘯洋建立的豬附紅細胞體PCR診斷方法對血液樣本進行PCR檢測，確定各組小鼠的豬附紅細胞體感染情況。

1.6 小鼠的血液學指標檢測

在接種第7天，分別在A、B、C組隨機選取5只昆明種小白鼠進行眼球采血。小鼠血液用肝素鋰抗凝，使用普朗醫(yī)療血液常規(guī)分析儀檢測小鼠血常規(guī)。用移液器吸取100 mL EDTA抗凝全血加入生化試劑盤中，將試劑盤放入斯馬特全自動生化分析儀中檢測各組小鼠血液生化指標。

1.7 小鼠繼發(fā)感染弗格森埃希菌試驗

根據(jù)相思宇對弗格森埃希菌LD的測定結(jié)果，在接種豬附紅細胞體第7天，分別在A、B、C組隨機選取5只昆明種小白鼠注射LD劑量的（2.944×10CFU）弗格森埃希菌，記錄各組動物數(shù)、死亡數(shù)，計算死亡率并進行統(tǒng)計學分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010與SPSS統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，當0.01＜＜0.05時，表示差異顯著；當＜0.01時，表示差異極顯著；當＞0.05時，表示差異不顯著。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般性臨床癥狀觀察

在整個試驗周期內(nèi)，A組（空白對照組）小鼠無臨床癥狀；B組（陰性對照組）小鼠出現(xiàn)精神萎靡、扎堆、被毛逆立等臨床癥狀；C組（治療模型組）經(jīng)土霉素治療后小鼠臨床癥狀消失，恢復正常。

如表1所示，接種后5～10 d，與A組相比，B組小鼠平均日增質(zhì)量減少，差異極顯著（＜0.01）；C組與A組相比平均日增質(zhì)量差異不顯著（＞0.05）。其他時間，各組平均日增質(zhì)量均差異不顯著。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，C組小鼠日增質(zhì)量減少有顯著改善。

表1 各組小鼠平均日增質(zhì)量測定結(jié)果 g/d

如表2所示，與A組相比，B組在接種后第4天體溫降低，第7～19天體溫升高，差異顯著 （＜0.05）；C組與A組相比體溫變化均差異不顯著。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，C組小鼠體溫變化有顯著改善。

表2 各組小鼠體溫測定結(jié)果 ℃

2.2 小鼠血液樣本的PCR檢測

以模型小鼠血液DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果顯示，A組在整個試驗周期內(nèi)并未檢測到特異性條帶，B組出現(xiàn)特異性條帶，C組治療前出現(xiàn)特異性條帶，治療后條帶消失，與預期結(jié)果相符。

2.3 小鼠的血液學指標檢測

對各組昆明種小白鼠進行眼球采血，并進行血常規(guī)及血液生化指標檢測。如表3所示，與A組小鼠相比，B組小鼠白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、粒細胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，差異極顯著 （＜0.01）；淋巴細胞百分比、血小板壓積減小，差異顯著（＜0.05）；血小板分布寬度增大，差異顯著 （＜0.05）。與B組小鼠相比，C組小鼠血紅蛋白含量和血小板含量顯著升高（＜0.01）。與A組小鼠比較，C組小鼠白細胞數(shù)量降低，差異極顯著 （＜0.01）；淋巴細胞數(shù)、粒細胞數(shù)降低，差異顯著 （＜0.05）。結(jié)果表明，豬附紅細胞體感染會引起小鼠白細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)、粒細胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，淋巴細胞百分比、血小板壓積減小，血小板分布寬度增大，經(jīng)土霉素治療，淋巴細胞百分比、血紅蛋白含量、血小板含量、血小板壓積等指標恢復正常，但白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、粒細胞數(shù)均未恢復正常。

表3 各組小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

如表4所示，與A組小鼠相比，B組小鼠球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量顯著升高（＜0.05），白球比顯著降低（＜0.05）；與B組相比，C組小鼠球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量降低，差異顯著（＜0.05）。結(jié)果表明，豬附紅細胞體感染會引起球蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶含量降低，白球比升高，可能對昆明種小白鼠肝臟造成損傷，從而引起機體黃疸，而土霉素針對豬附紅細胞體感染引起的癥狀能起到良好的治療作用。

表4 各組小鼠血液生化指標檢測結(jié)果

2.4 各組小鼠繼發(fā)感染弗格森埃希菌試驗

如圖1所示，在感染高峰（豬附紅細胞體接種后第7天），與A組、C組相比，B組小鼠死亡率顯著升高（＜0.01）。結(jié)果表明，豬附紅細胞體感染后繼發(fā)感染弗格森埃希菌會提高昆明種小白鼠的死亡率，而經(jīng)土霉素治療后死亡率顯著降低。

圖1 豬附紅細胞體感染第7天繼發(fā)感染弗格森埃希菌 對昆明種小白鼠死亡率的影響

3 討論

該試驗采用分離純化的豬附紅細胞體感染未切脾的昆明種小白鼠，豬附紅細胞體感染劑量為1×10個/只。對整個試驗周期的昆明種小白鼠進行精神狀態(tài)、體質(zhì)量及體溫監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，昆明種小白鼠感染豬附紅細胞體后出現(xiàn)精神萎靡、扎堆、被毛逆立等臨床癥狀；B組在豬附紅細胞體感染后5～10 d平均日增質(zhì)量顯著低于其他組，表明豬附紅細胞體感染導致昆明種小白鼠的日增質(zhì)量下降，與Messick等的研究結(jié)果一致；體溫監(jiān)測結(jié)果表明，豬附紅細胞體感染能夠使昆明種小白鼠體溫異常，與前人研究一致。另外，Hoelzle等認為傳統(tǒng)的抗生素和衛(wèi)生管控方法不能將豬附紅細胞體從感染豬體內(nèi)完全清除，雖然其臨床癥狀消失，但仍是豬附紅細胞體的隱性攜帶者。該試驗感染豬附紅細胞體的昆明種小白鼠經(jīng)土霉素治療后，PCR檢測未出現(xiàn)特異性條帶。

血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，昆明種小白鼠感染豬附紅細胞體后，白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、粒細胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板含量降低，其余指標無顯著性變化，治療模型組治療后白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)和粒細胞數(shù)并未恢復，其余指標恢復正常。與王洋等研究不同的是，該試驗B組小鼠血常規(guī)檢測中白細胞數(shù)量減少。豬附紅細胞體本身屬于血液系統(tǒng)疾病，主要侵害紅細胞，可使患病動物免疫力下降，且該試驗使用分離純化的豬附紅細胞體為感染源對昆明種小白鼠進行急性感染，白細胞數(shù)量減少常出現(xiàn)于血液系統(tǒng)疾病和自身免疫系統(tǒng)疾病中，一些急性感染也可導致白細胞數(shù)量減少。因此，該試驗檢測到的B組小鼠白細胞數(shù)量減少可能是由上述原因造成的。血常規(guī)檢測結(jié)果表明，豬附紅細胞體主要侵害骨髓和紅細胞，導致造血功能低下，出現(xiàn)貧血，這與Hoelzle等研究結(jié)果一致。以往研究并未對豬附紅細胞體感染小鼠的血液生化指標進行檢測，多進行血常規(guī)檢測，該試驗對各組小鼠進行貧血和黃疸相關(guān)血液生化指標檢測，以便更加全面地驗證土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型。B組小鼠的堿性磷酸酶（ALP）顯著升高，病理學觀察發(fā)現(xiàn)B組小鼠皮下輕微黃染，C組和A組小鼠無黃染現(xiàn)象，證明豬附紅細胞體能夠?qū)е聞游矬w出現(xiàn)黃疸的臨床癥狀，經(jīng)土霉素治療后指標恢復正常。這也進一步說明該研究初步建立的土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型是成功的。

豬附紅細胞體多呈隱性感染，容易繼發(fā)感染其他病原體，繼發(fā)感染其他病原體的患病動物表現(xiàn)出復雜的臨床癥狀，為該病的診療帶來極大的困難。為了模擬現(xiàn)實中的繼發(fā)感染，該試驗設計了小鼠繼發(fā)感染試驗。由于弗格森埃希菌具有致病力弱、環(huán)境常在、人畜共患、條件致病等特點，更能凸顯出治療豬附紅細胞體病對小鼠的影響，且更接近現(xiàn)實環(huán)境，因而選擇弗格森埃希菌作為再次感染病原。結(jié)果表明，經(jīng)土霉素治療后，感染豬附紅細胞體的小鼠死亡率與未感染豬附紅細胞體的小鼠死亡率差異不顯著。這也進一步驗證該研究初步建立的治療模型是成功的。

綜上，該研究初步建立了土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型，并在一般指標、臨床癥狀、血液學指標和繼發(fā)感染等方面驗證了土霉素治療豬附紅細胞體病小鼠模型的成功。該模型可為豬附紅細胞體病治療藥物的篩選和該病治療機制的研究提供參考數(shù)據(jù)。