circMTO1調控Wnt/β-catenin抑制乳腺癌細胞增殖和轉移能力的機制研究

蘇亞靜，吳煥良，敬波，吳燦章

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，也是全球女性因癌癥死亡的主要原因之一［1］。隨著醫療技術的進步，乳腺癌患者的生存率已有了明顯的提升，但整體預后情況仍較差［2］。研究顯示，腋窩淋巴結轉移是乳腺癌患者預后重要影響因素之一［3］。因此，確定乳腺癌轉移的潛在分子機制對開發新的治療靶點非常重要。環狀RNA MTO1（circMTO1）是腫瘤相關環狀RNA之一。研究顯示，circMTO1在包括卵巢癌和腎細胞癌在內的多種腫瘤中低表達，發揮著抑癌基因的作用［4-5］。Chen等［6］研究顯示，circMTO1在宮頸癌細胞系和腫瘤組織中表達上調，其可促進宮頸癌細胞遷移和侵襲，增加化療耐藥性，并可抑制腫瘤細胞凋亡。因此，circMTO1在不同腫瘤中發揮的作用可能相反，但鮮見circMTO1與乳腺癌的相關研究。研究表明，circMTO1可通過降低Wnt/β-catenin、轉化生長因子-β（TGF-β）/母系DPP同源物以及表皮生長因子受體（EGFR）信號通路活性，抑制結直腸癌和膽囊癌的惡性進展［7-8］。Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進乳腺癌的惡性進展，抑制該通路活性有望成為抗腫瘤治療的新思路［9］。本研究旨在探討circMTO1與乳腺癌細胞增殖和轉移能力的關系及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人乳腺正常細胞系MCF-10A購自美國ATCC細胞庫；RPMI 1640培養基、Eagle培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶購自美國Invitrogen公司；Trizol、SYBR Premix EX Taq試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）實驗檢測試劑盒購自日本TAKARA試劑公司；氯仿、異丙醇和無水乙醇購自深圳中粵化學有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；circMTO1過表達和circMTO1敲減質粒購自上海吉瑪基因技術有限公司；MTS試劑購自上海同仁化學技術有限公司產品；Transwell小室購自北京Solarbio試劑公司；蘇木素和熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白質測定試劑盒、Lip2000購自美國Thermo公司；PVDF膜購自美國Promega公司；Wnt3a、βcatenin、cMyc、Cyclin D1、基質金屬蛋白酶7（MMP7）和GAPDH一抗、HRP偶聯的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自英國Abcam公司。

1.2 臨床樣本 選取2018年9月—2020年6月于海南醫學院附屬儋州市人民醫院就診的102例浸潤性乳腺癌患者，收集患者的癌組織及癌旁組織，診斷標準參照2012年《乳腺腫瘤WHO分類》。納入標準：患者術前未接受化療、放療、內分泌或其他任何形式的治療；具備手術切除的新鮮腫瘤組織和癌旁組織；具有完整的臨床病理資料。排除標準：合并其他器官腫瘤；發生遠處轉移。患者均簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 qPCR檢測乳腺癌組織中circMTO1的相對表達水平 使用TRIzol試劑從乳腺癌組織中提取總RNA。采用紫外分光光度儀對RNA樣品進行純度與濃度的檢測，光密度（OD）260/280為1.8～2.0。采用逆轉錄試劑盒在70℃下孵育10 min，室溫下以1 000×g離心20 min，采用逆轉錄試劑盒將細胞總RNA逆轉錄為cDNA。circMTO1引物：上游5'-GCATCGGAAAGGGACATTTA-3'，下游5'-AGCTCTCAGACCCCACACAG-3'；GAPDH引物：上游5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，下游5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。反應體系：SYBR Premix EX TaqTM（2×）12.5μL，PCR上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 9.5 μL。熱循環條件：45℃逆轉錄5 min，94℃30 s；94℃退火5 s、60℃延伸30 s，40個循環，每個樣品重復3次。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算circMTO1的相對表達水平。

1.3.2 乳腺癌細胞培養、分組及轉染MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7細胞培養在含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中；MCF-10A細胞培養在含有20μg/L EGF、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的Eagle培養基中。所有細胞均在37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。每24 h更換1次新鮮培養基，并在細胞密度為90%時，采用胰酶消化細胞進行傳代。

參 照1.3.1，采 用qPCR檢 測MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和MCF-10A細胞中circMTO1的相對表達量，并選取circMTO1表達量中等的乳腺癌細胞系轉染circMTO1過表達和circMTO1敲減質粒。細胞生長狀態較好時，胰酶進行消化并計數，以2×105個細胞接種至6孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養12 h后，細胞分為NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組。采用Lip2000進行轉染，其中NC組細胞轉染5μg無關序列，oe-circMTO1組細胞轉染5μg circMTO1過表達質粒，sh-circMTO1組細胞轉染5μg circMTO1敲減質粒，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養8 h，更換新鮮培養基，繼續培養48 h，參照1.3.1，采用qPCR檢測各組細胞circMTO1的相對表達量。

1.3.3 MTS實驗檢測各組細胞增殖能力 采用胰酶將轉染48 h的NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細胞制成單細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次后，加入含10%胎牛血清的培養基，將細胞調至1×104個/mL。取100μL細胞懸液接種于96孔板中，每組設置6個復孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中常規培養。在細胞貼壁的第0、24、48和72 h時更換新鮮培養基并加入20μL的MTS試劑，采用全波長自動掃描儀檢測490 nm處的OD值。

1.3.4 Transwell實驗檢測各組細胞轉移能力 采用胰酶將轉染48 h的NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細胞制成單細胞懸液，無血清培養基洗3次后，加入無血清培養基，將 細 胞 調 至1×106個/mL。取100 μL細 胞 懸 液 接 種 于Transwell小室的上室中，下室中加入500μL添加10%胎牛血清的細胞培養基，每組3個復孔，放置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中常規培養12 h。無菌棉簽輕輕擦去上室表面細胞，PBS洗3次后采用5%戊二醛固定細胞10 min，蘇木素染色20 min，PBS洗3次，顯微鏡下計數各組穿膜的細胞數。

1.3.5 TOP/FOP熒光素酶實驗檢測各組細胞Wnt/β-catenin信號通路活性 細胞生長狀態較好時，胰酶進行消化并計數，以2 000個細胞接種至96孔板，于37℃、5%CO2加濕培養箱中培養12 h，細胞分為NC組、oe-circMTO1組和shcircMTO1組。采用Lip2000進行轉染，3組分別轉染1μg無關序列、1μg circMTO1過表達質粒和5μg circMTO1敲減質粒，并同時轉染1μg TOP/FOP質粒，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養8 h，更換新鮮培養基，繼續培養48 h，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組細胞中熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot實驗檢測各組細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達 將NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細胞轉染48 h后采用預冷的PBS洗滌，加入含有1%蛋白酶抑制劑混合物的蛋白裂解液，在冰上裂解30 min。14 000 r/min離心30 min，裂解細胞，收集細胞蛋白，采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取50μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并采用常規濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，封閉膜后采用一抗Wnt3a（1∶500）、β-catenin（1∶1 000）、cMyc（1∶500）、Cyclin D1（1∶1 000）和MMP7（1∶1 000）4℃孵育過夜，采用羊抗鼠二抗（1∶10 000）37℃孵育1 h，增強型化學發光檢測試劑盒進行化學發光顯色。采用Image J軟件分析，以目的條帶蛋白的灰度值和內參GAPDH蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circMTO1在乳腺癌組織中的相對表達量 與癌旁組織（1.04±0.35）相比，circMTO1在乳腺癌組織（0.87±0.29）中的相對表達水平降低（n=102，t=3.777，P＜0.05）。

2.2 circMTO1相對表達量與乳腺癌患者臨床病理參數的關系 不同年齡、腫瘤大小、組織分級以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體-2（HER-2）陰、陽性表達乳腺癌患者的circMTO1相對表達水平差異無統計學意義。有淋巴結轉移和TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌患者組織中circMTO1的相對表達水平較低（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of circMTO1 expression in the breast cancer tissue of patients with different clinical pathological parameters表1不同臨床病理參數患者乳腺癌組織中circMTO1表達量比較 （±s）

Tab.1 Comparison of circMTO1 expression in the breast cancer tissue of patients with different clinical pathological parameters表1不同臨床病理參數患者乳腺癌組織中circMTO1表達量比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

臨床參數年齡（歲）≤60＞60腫瘤大小（cm）≤2＞2組織分級Ⅰ-ⅡⅢ淋巴結轉移有無TNM分期Ⅰ-ⅡⅢER陽性陰性PR陽性陰性HER-2陽性陰性n 72 30 43 59 38 64 58 44 42 60 32 70 35 67 61 41 circMTO1相對表達量0.89±0.33 0.82±0.24 0.93±0.34 0.83±0.24 0.91±032 0.85±0.27 0.78±0.26 0.99±0.35 1.00±0.34 0.78±0.25 0.84±0.26 0.88±0.30 0.81±0.26 0.90±0.31 0.84±0.27 0.92±0.31 t 1.051 1.172 1.012 3.478＊＊3.767＊＊0.650 1.468 1.382

2.3 circMTO1在乳腺癌細胞系中的相對表達水平circMTO1在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人正常乳腺細胞系MCF-10A中的相對表達水平分別為0.86±0.07、3.27±0.45、2.29±0.42和5.48±0.73（n=3，F=49.327，P＜0.01），與正常乳腺細胞系MCF-10A相比，circMTO1在乳腺癌細胞中的表達均降低（P＜0.05）。選取MCF-7細胞進行后續實驗。

2.4 各組細胞中circMTO1的相對表達水平比較 與NC組相比，oe-circMTO1組細胞中circMTO1相對表達水平增加，穿膜細胞數和Wnt/β-catenin信號通路活性減弱（P＜0.05），sh-circMTO1組細胞中circMTO1相對表達水平降低，穿膜細胞數和Wnt/βcatenin信號通路活性增強（P＜0.05），見表2，圖1。

Tab.2 Comparison of relative expression level,metastasis and Wnt/β-catenin of catenin signaling pathway between the three groups of cells表2各組細胞中circMTO1相對表達水平、轉移情況和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較 （±s）

Tab.2 Comparison of relative expression level,metastasis and Wnt/β-catenin of catenin signaling pathway between the three groups of cells表2各組細胞中circMTO1相對表達水平、轉移情況和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與oe-circMTO1組比較，P＜0.05。

組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F n 333 circMTO1相對表達水平1.01±0.02 3.57±0.55a 0.41±0.11ab 80.472＊＊穿膜細胞數（個/視野）69.33±6.81 32.67±4.25a 98.33±5.34ab 104.829＊＊TOP/FOP熒光素酶活性0.97±0.03 0.49±0.03a 1.69±0.12ab 202.667＊＊

Fig.1 Effect of circMTO1 on breast cancer cell metastasis detected by Transwell experiment(Hematoxylin staining,×200)圖1 circMTO1對乳腺癌細胞轉移能力的Transwell實驗檢測結果（蘇木素染色，×200）

2.5 各組細胞增殖能力比較 與NC組相比，在48 h、72 h時，oe-circMTO1組MCF-7細胞增殖能力降低，sh-circMTO1組MCF-7細胞增殖能力增加（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 MTS detection of the effect of circMTO1 on the proliferation of breast cancer cells in each group圖2 MTS檢測circMTO1對各組乳腺癌細胞增殖能力的影響

2.6 各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平比較 與NC組相比，oe-circMTO1組Wnt3a、βcatenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白相對表達水平降低，而sh-circMTO1組各蛋白相對表達水平增加（均P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 Effects of circMTO1 on proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway in breast cancer cells圖3 circMTO1對乳腺癌細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathwayrelated protein expressions between the three groups of cells表3各組細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白相對表達水平的比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathwayrelated protein expressions between the three groups of cells表3各組細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白相對表達水平的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與oe-circMTO1組比較，P＜0.05。

組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F cMyc 0.52±0.02 0.17±0.02a 1.47±0.20ab 99.816＊＊Cyclin D1 0.64±0.05 0.28±0.02a 1.89±0.11ab 428.420＊＊MMP7 0.45±0.06 0.33±0.03a 1.97±0.18ab 203.837＊＊組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F Wnt3a 0.42±0.04 0.15±0.02a 1.02±0.09ab 176.703＊＊β-catenin 0.48±0.05 0.19±0.03a 1.56±0.18ab 131.036＊＊

3 討論

乳腺癌的發生、發展是一個復雜的過程，涉及多種調節因子和信號途徑。circRNA是新近發現的非編碼RNA，為一個連續的共價閉環結構。circRNA在細胞功能調節、神經退行性疾病的發展和心臟病的發病機制中發揮著關鍵作用［10］。越來越多的證據表明，circRNA可作為腫瘤抑制基因或致癌基因，并參與調節各種腫瘤的惡性生物學行為，包括細胞的分化、增殖、轉移和化學敏感性等［11］。乳腺癌中異常表達的circRNA也被逐漸發現，有望作為乳腺癌診斷、治療及預后判斷的分子標志物［12］。

circMTO1最 初 由Han等［13］在 肝 細 胞 癌 環 狀RNA的表達譜中發現，circMTO1在肝細胞癌組織中呈異常低表達，且circMTO1低表達患者的預后較差。本研究結果顯示，circMTO1在乳腺癌組織中表達較癌旁組織顯著下調，且circMTO1低表達與乳腺癌患者淋巴結轉移和TNM分期為Ⅲ期有關，表明circMTO1可能抑制乳腺癌的惡性進展，提示circMTO1在乳腺癌中發揮著抑癌因子的作用，這與其在肝癌中發揮的作用一致［13］。與正常乳腺細胞系相比，circMTO1在乳腺癌細胞中的表達降低，這與在組織中的檢測水平一致。circMTO1在卵巢癌和腎細胞癌中也發揮著抑癌因子的作用［4-5］。另外，本研究發現，過表達circMTO1具有抑制乳腺癌細胞增殖和轉移能力，敲減circMTO1后則可促進乳腺癌細胞的增殖和轉移，提示circMTO1可抑制乳腺癌細胞的惡性進展。

目前，circMTO1在乳腺癌中的作用機制尚不完全清楚。相關研究顯示，在結直腸癌中，circMTO1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，從而降低癌細胞的增殖和侵襲能力［7］。Wnt/β-catenin信號通路可調控腫瘤增殖、侵襲、轉移、凋亡和化療耐藥等多種生物學過程［14］。本研究結果顯示，過表達circMTO1顯著抑制乳腺癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性，敲減circMTO1后乳腺癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性增加，提示circMTO1可抑制乳腺癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性。在正常生理狀態下，β-catenin破壞復合體抑制βcatenin蛋白的積累，Wnt/β-catenin信號通路處于失活狀態，在腫瘤細胞中，Wnt配體存在時，β-catenin破壞復合體被降解，β-catenin蛋白積累并異位至核內，促使Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因激活，發揮相應的生物學功能［15-16］。本研究結果顯示，過表達circMTO1顯著抑制乳腺癌細胞中Wnt/βcatenin信號通路下游增殖蛋白cMyc、Cyclin D1和下游轉移蛋白MMP7的表達，敲減circMTO1則反之，表明circMTO1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，從而抑制乳腺癌細胞增殖和轉移能力。

綜上所述，circMTO1在乳腺癌組織和細胞中表達降低，且circMTO1具有抑制乳腺癌細胞增殖和轉移能力，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性可能是其重要的作用機制之一。circMTO1具有作為乳腺癌治療分子靶標的潛力。