miR-196b-5p減輕大鼠脊髓損傷后組織水腫和星形膠質細胞活化機制探討

孔俊東，李堅，張強強，李剛，蔡家駿，范仲凱△

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后繼發性水腫是SCI的重要病理過程，通常在SCI后2 h出現，在3 d內達到高峰［1-2］。水通道蛋白4（AQP4）是主要的選擇性水通道蛋白，主要表達于神經元和血管周圍的星形膠質細胞足突中，參與中樞神經系統水腫的形成過程［3］。SCI后，星形膠質細胞活化增生形成反應性星形膠質細胞（RA），表達膠質纖維酸性蛋白（GFAP）并參與膠質瘢痕的形成，阻礙SCI后脊髓修復過程［4］。既往研究發現，抑制SCI后AQP4的表達除能夠減輕脊髓水腫外，還能降低GFAP的表達，抑制星形膠質細胞的活化增生［5-6］。因此，脊髓水腫與星形膠質細胞活化增生之間可能存在一定的聯系，但具體機制尚不明確。微小RNA（miR）在多種生理病理活動中發揮著重要作用［7-8］。既往研究發現，miR-196b-5p可通過下調AQP4的表達抑制胃癌的進展［9］，但鮮見在SCI領域中miR-196b-5p與AQP4關系的研究。本研究旨在探討miR-196b-5p對大鼠SCI后水腫和星形膠質細胞活化增殖的影響，以期為SCI的治療尋求新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年雌性SPF級SD大鼠78只，體質量180～220 g，由錦州醫科大學SPF級實驗動物中心［動物生產許可證號SYXK（遼）2019-0007］提供。miR-196b-5p模擬物（agomiR-196b-5p）/miR-196b-5p陰 性 對 照（antagomiR-196b-5p）購自蘇州吉瑪生物科技有限公司，使用DEPC處理水溶解，濃度60 nmol/L。重組質粒AQP4野生型/突變型（AQP4 WT/MUT）和miR-196b-5p模擬物/陰性對照（miR-196b-5p mimicis/mimicis control）由湖南普拉特澤公司構建。PrimeScriptTMRT reagent with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本Takara公司；miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔源AQP4多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔源GFAP、SCI 4周的生長相關蛋白43（GAP-43）單克隆抗體，鼠源增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體，HRP標記山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠源β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot預制膠、超敏ECL化學發光檢測試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型建立及分組18只成年雌性SD大鼠采用隨機數字表法分為假手術（Sham）組及SCI 1、2、3、5及7 d組，每組3只。另外60只成年雌性SD大鼠按照隨機數字表法分為Sham組、SCI組、agomiR-196b-5p干預（miRNA）組和miR-196b-5p陰性對照（NC）組，每組15只，每組再使用隨機數字表法分為5個亞組，每個亞組3只。Sham組僅行椎板去除術，SCI組、miRNA組和NC組均采用改良后大鼠脊髓擠壓裝置誘導大鼠中度脊髓損傷，擠壓時大鼠出現后肢痙攣性顫動和尾巴痙攣性擺動，麻醉蘇醒后呈雙下肢弛緩性癱瘓視為造模成功［10］。在誘導SCI成功后，miRNA組和NC組使用微量注射器分別向大鼠鞘內注射agomiR-196b-5p與antagomiR-196b-5p，20μL/d，連續3 d，Sham組和SCI組注射等量生理鹽水。大鼠出現擺尾反射，回抽出現腦脊液視為微量注射器插入髓鞘內。2只大鼠造模后死亡，1只大鼠未成功誘導SCI被剔除并及時補齊相應分組。術后每日腹腔注射青霉素8萬單位預防感染，連續3 d。人工協助大鼠排尿，早晚各1次，直至大鼠排尿反射恢復。所有動物飼養溫度為（24±2）℃，濕度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，食物、水分充足供應。實驗大鼠的模型操作和術后護理遵循中國實驗動物保護和倫理委員會規定。

1.2.2 雙熒光素酶報告實驗 應用TargetScan（https://www.targetscan.org）和miRDB（http://mirdb.org）數據庫預測AQP4的上游調控基因，通過篩選發現miR-196b-5p是AQP4的上游調控基因。使用雙熒光素酶檢測報告檢測miR-196b-5p與AQP4之間的靶向關系。miR-196b-5p mimics與AQP4 WT或AQP4 MUT質粒共轉染293T細胞，并以mimics control為對照。轉染48 h后，多功能酶標儀分別檢測螢火蟲熒光素酶反應強度和海腎熒光素酶反應強度。實驗結果以兩熒光素酶相對熒光強度表示，重復3次。

1.2.3 RT-qPCR檢 測SCI后 脊 髓miR-196b-5p與AQP4mRNA表達Sham組及SCI后1、2、3、5及7 d組大鼠以損傷點為中心取長度約為1 cm的脊髓組織，采用低溫勻漿儀勻漿30 s，Trizol試劑提取各樣本總RNA，檢測miR-196b-5p及AQP4在不同時間點表達水平。miR-196b-5p和AQP4分別使用第一鏈合成試劑盒逆轉錄成相應cDNA模板。miRNA RT-qPCR反應體系：2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 1μL，DEPC處理水8.6μL。反應條件：95℃預變性15 min；94℃變性20 s，60℃退火延伸34 s，40個循環。U6作為標準內參。miR-196b-5p及U6引物由廣州銳博生物公司合成（序列保密）。AQP4 RT-qPCR反應體系：2×SYBR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 1μL，DEPC處理水5μL。反應條件：95℃預變性1 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環。GAPDH作為內參。AQP4及GAPDH引物由武漢塞維爾公司合成，相對表達水平以2-ΔΔCt法計算，引物序列見表1。

1.2.4 干濕質量法檢測脊髓組織含水量 術后3 d，收集大鼠以損傷點為中心的長度為1 cm的新鮮脊髓組織，用高靈敏度分析天平（METFLERAE26）稱質量（濕質量），隨后放入80℃恒溫烘箱中烘干48 h，連續稱質量直至質量穩定不再變化（干質量），每個樣本連續測量3次，取平均值。按埃利奧特（Ellicot）公式計算組織含水量：含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.2.5 Western blot法檢測AQP4、GFAP、PCNA和GAP-43表達水平 術后3 d，以損傷點為中心，取長度約為1 cm的脊髓組織。加入適量的RIPA后依次經過剪碎、組織破碎、細胞破碎、靜止30 min、4℃12 000 r/min離心20 min后取蛋白上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟測定各樣本的蛋白濃度。每組蛋白上樣量30 μg，在室溫進行SDS-PAGE電泳，將凝膠上蛋白轉至PVDF膜上，1%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜后加入稀釋好的一抗AQP4（1∶1 000）、GFAP（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、β-actin（1∶1 500）并于4℃冰箱孵育過夜，次日洗膜后，加入對應二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL化學發光法顯色。術后4周，以同樣方法取得脊髓組織并檢測GAP-43表達水平。

1.2.6 HE染色檢測大鼠脊髓空洞大小 術后4周取脊髓，脊髓縱向切片在去離子水中洗滌5 min，依次進行二甲苯浸泡，梯度乙醇脫水，蘇木精染色2 min，伊紅染色15 s，中性樹膠封片。染色圖像使用Image J軟件測量空洞相對大小。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-196b-5p可調控AQP4基因表達 雙熒光素酶報告實驗顯示，與對照質粒比較，miR-196b-5p mimics與AQP4 3'-UTR野生型質粒共轉染后，細胞熒光素酶活性下降（P＜0.01）；而miR-196b-5p與AQP4 3'-UTR突變型質粒共轉染后，熒光素酶活性與對照質粒差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 各組脊髓miR-196b-5p與AQP4 mRNA表達水平比較 與Sham組比較，SCI后各時間點miR-196b-5p相對表達水平降低（均P＜0.05）。與Sham組比較，SCI 1 d、2 d、3 d和5 d組AQP4 mRNA相對表達水平升高（均P＜0.05）；與SCI 2 d組比較，SCI 1 d、3 d、5 d及7 d組AQP4 mRNA相對表達水平降低（P＜0.05），見表2。

Fig.1 Prediction and validation of the targeting relationship between AQP4 and miR-196b-5p圖1 AQP4與miR-196b-5p靶向關系的預測與驗證

Tab.2 Expression levels of miR-196b-5p and AQP4 in groups of rats after SCI表2 SCI后各組大鼠miR-196b-5p與AQP4表達變化（n=3，±s）

Tab.2 Expression levels of miR-196b-5p and AQP4 in groups of rats after SCI表2 SCI后各組大鼠miR-196b-5p與AQP4表達變化（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與SCI 1 d組比較，c與SCI 2 d組比較，P＜0.05；表3、4同。

組別Sham組SCI 1 d組SCI 2 d組SCI 3 d組SCI 5 d組SCI 7 d組F miR-196b-5p 1.00±0.15 0.01±0.00a 0.02±0.00a 0.07±0.01a 0.11±0.02a 0.11±0.02a 119.063＊＊AQP4 mRNA 1.00±0.18 13.96±1.30a 25.61±2.04ab 16.15±0.78ac 10.79±1.49ac 3.84±0.64c 156.183＊＊

2.3 各組miR-196b-5p、AQP4及脊髓組織含水量比較 與Sham組比較，SCI組、miRNA組和NC組AQP4 mRNA及蛋白相對表達水平、脊髓含水量增加，而SCI組及NC組miR-196b-5p相對表達水平降低（均P＜0.05）；與miRNA組比較，SCI組和NC組AQP4 mRNA及蛋白相對表達水平、脊髓含水量增加，而miR-196b-5p表達水平降低（均P＜0.05）；SCI組與NC組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3、圖2A。

2.4 各組GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對表達水平比較 與Sham組比較，SCI組、miRNA組及NC組GFAP、PCNA和GAP-43蛋白相對表達水平升高（均P＜0.05）；與SCI組及NC組比較，miRNA組GFAP、PCNA相對表達水平降低，GAP-43相對表達水平升高（均P＜0.05）；SCI組與NC組各蛋白相對表達水平差異無統計學意義，見圖2B、C，表4。

2.5 miR-196b-5p促 進SCI后 脊 髓 修 復Sham組脊髓結構完整，無損傷空洞，SCI組、miRNA組及NC組出現明顯脊髓空洞，見圖3。SCI組、miRNA組、NC組脊髓空洞相對面積分別為（1.00±0.04）、（0.49±0.03）及（1.00±0.01），差異有統計學意義（n=3，F=338.227，P＜0.05），miRNA組脊髓空洞面積小于SCI組和NC組（P＜0.05），SCI組及NC組差異無統計學意義。

Tab.3 Changes of miR-196b-5p,AQP4 and water content after treatment in four groups of rats表3干預后各組大鼠miR-196b-5p、AQP4及脊髓含水量變化 （n=3，±s）

Tab.3 Changes of miR-196b-5p,AQP4 and water content after treatment in four groups of rats表3干預后各組大鼠miR-196b-5p、AQP4及脊髓含水量變化 （n=3，±s）

組別Sham組SCI組miRNA組NC組F miR-196b-5p 1.00±0.15 0.15±0.02a 0.86±0.03b 0.25±0.06ac 80.655＊＊AQP4 mRNA 1.00±0.31 24.12±2.26a 9.66±0.30ab 25.53±4.14ac 74.657＊＊AQP4 0.78±0.16 2.67±0.37a 1.86±0.26ab 2.68±0.30ac 30.444＊＊脊髓含水量（%）70.17±0.18 74.18±0.23a 72.31±0.17ab 74.38±0.20ac 299.531＊＊

Fig.2 Effects of AQP4,GFAP,PCNA and GAP-43 protein expression levels after SCI in four groups of rats圖2各組大鼠SCI后對AQP4、GFAP、PCNA及GAP-43蛋白表達水平的影響

Tab.4 Comparison of relative expression levels of GFAP,PCNA and GAP-43 protein between the four groups of rats表4各組大鼠GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of relative expression levels of GFAP,PCNA and GAP-43 protein between the four groups of rats表4各組大鼠GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對表達水平比較 （n=3，±s）

組別Sham組SCI組miRNA組NC組F GFAP 1.00±0.12 1.99±0.21a 1.48±0.01ab 1.88±0.11ac 34.792＊＊PCNA 1.00±0.18 16.95±1.42a 11.29±1.02ab 16.18±0.91ac 164.079＊＊GAP-43 1.00±0.03 1.72±0.16a 2.78±0.06ab 1.81±0.04ac 194.353＊＊

3 討論

MiRNA廣泛存在于中樞神經系統［11］。大量研究表明，多種miRNA與SCI后繼發性損傷有關，如通過鞘內注射miR-125a-5p可以有效保護SCI后大鼠血-脊髓屏障功能并促進運動功能的恢復［12］；miR-29b可以減弱缺血誘導的血腦屏障破壞和腦水腫形成，減少缺血后梗死體積［13］；miR-126可以影響新血管形成，從而促進大鼠脊髓損傷后脊髓組織和運動功能恢復［14］。miRNA一般通過與靶基因3'-UTR區結合而沉默靶基因［15］。本研究通過TargetScan和miRDB數據庫預測發現，AQP4 3'-UTR區與miR-196b-5p存在互補結合位點，并通過雙熒光素酶報告驗證了AQP4與miR-196b-5p之間的靶向關系。通過RT-qPCR發現，SCI后miR-196b-5p表達下降而AQP4表達升高，表明miR-196b-5p可能能夠抑制AQP4的表達，這與Li等［9］的研究相符。

Fig.3 Results of spinal cord repair after SCI in four groups of rats(HE,×50)圖3各組大鼠SCI后脊髓損傷修復結果（HE，×50）

SCI后繼發性水腫可迅速引起髓鞘內壓力增大，局部組織缺血壞死，加劇神經元的損傷和運動功能的喪失［16-17］。AQP4參與血-脊髓屏障及中樞神經系統水腫的形成，是SCI誘導水腫的主要參與者，抑制AQP4的表達能有效降低SCI后脊髓水腫程度［3］。另有研究發現，過表達的miR-196b-5p同樣能抑制GFAP與PCNA的表達，這表明過表達的miR-196b-5p不僅能夠減輕脊髓水腫，還能抑制星形膠質細胞的活化增生［18］。本研究亦證實，過表達的miR-196b-5p能在基因和蛋白水平抑制AQP4的表達，并降低脊髓含水量。星形膠質細胞活化形成RA參與膠質瘢痕的形成，通過級聯反應刺激炎癥細胞因子和具有神經毒性的活性氧等物質產生和釋放，阻礙神經元軸突延伸和神經修復，因此，抑制膠質瘢痕的形成對SCI的恢復具有重要意義［19-20］。本研究結果顯示，過表達的miR-196b-5p能上調神經元軸突再生的標志蛋白GAP-43的表達并減小脊髓空洞的面積，這表明過表達的miR-196b-5p能夠促進SCI后脊髓組織修復和神經元軸突再生。AQP4參與SCI后定位于星形膠質細胞的細胞毒性水腫，并通過抑制細胞色素氧化酶5A（cytochrome coxidase，COX5A）的表達，而影響星形膠質細胞能量代謝［21］。因此，筆者推測AQP4可能是通過介導能量代謝的方式使星形膠質細胞處于應激狀態，促使其向RA轉變并增殖，形成膠質瘢痕組織，阻礙神經元的再生。

綜上所述，過表達的miR-196b-5p可通過靶向抑制AQP4的表達，減輕SCI后脊髓水腫和星形膠質細胞的活化增生，減少膠質瘢痕的形成，促進SCI后神經元再生和組織修復，提示miR-196b-5p治療SCI有較大潛力。然而，對于AQP4與星形膠質細胞之間的聯系，miRNA在臨床工作中如何應用，其治療的有效性、安全性等問題還有待進一步研究。