腫瘤組織Ki67的表達(dá)與肝細(xì)胞癌肝移植患者預(yù)后的關(guān)系

陳池義，張煒琪，謝炎，蔣文濤

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。肝移植（liver transplantation，LT）是治療HCC最有效的手段之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的HCC患者LT術(shù)后5年生存率可達(dá)70%［2-3］。即便如此，仍有15%～20%符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［4-5］。因此，臨床需要可靠的指標(biāo)來反映患者的預(yù)后情況。Ki67是一種腫瘤增殖相關(guān)核蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的敏感標(biāo)志物，反映惡性腫瘤細(xì)胞的比例，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-7］。但有關(guān)Ki67的表達(dá)與肝癌肝移植患者預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究旨在探討腫瘤組織Ki67的表達(dá)與HCC患者LT術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年7月—2018年6月于天津市第一中心醫(yī)院接受原位肝移植的178例HCC患者的臨床資料。所有HCC患者均經(jīng)術(shù)后病理診斷，且術(shù)前影像學(xué)檢查均排除大血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。178例患者中，男156例，女22例，平均年齡（54.24±9.37）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次原位肝移植。（2）≥18歲的成年患者。（3）腫瘤無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管侵犯。（4）病理學(xué)檢查證實(shí)為HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多器官聯(lián)合移植。（2）混合性肝癌。（3）術(shù)前合并其他部位的腫瘤。（4）臨床及病理資料缺失。本研究經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（倫理號(hào)：2021N077KY）。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集患者術(shù)前資料包括年齡、性別、終末期肝病模型（model for end liver disease，MELD）評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血紅蛋白（HGB）水平、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、凝血酶原時(shí)間（PT）、血甲胎蛋白（AFP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TB）、白蛋白（ALB）水平，腫瘤個(gè)數(shù)和最大直徑，是否存在衛(wèi)星灶，是否存在微血管侵犯，腫瘤分化程度以及腫瘤組織Ki67標(biāo)簽指數(shù)（Ki67 labeling index，KLI）。所有資料均源自天津市第一中心醫(yī)院病歷系統(tǒng)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和病理檢查由本院檢驗(yàn)科和病理科完成。

1.2.2 肝移植手術(shù)與術(shù)后管理 所有患者均接受原位肝移植術(shù)，供肝均來源于中國公民逝世后器官捐獻(xiàn)。術(shù)后初始免疫抑制方案均采用他克莫司+霉酚酸酯類藥物+激素（藥物劑量根據(jù)血藥濃度調(diào)整）。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 腫瘤標(biāo)本石蠟病理切片，經(jīng)二甲苯脫蠟后進(jìn)行梯度乙醇水化，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，并以0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再行山羊血清封閉。Ki67抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1∶300）孵育4℃過夜。次日37℃復(fù)溫1 h后，生物素標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）孵育30 min，鏈霉卵白素工作液37℃孵育30 min，最后使用DAB二氨基苯甲胺顯色、沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。在20個(gè)高倍視野（400倍）下隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)的百分比即為KLI。

1.2.4 術(shù)后隨訪 患者出院后采用門診或電話方式隨訪。術(shù)后2年內(nèi)每2個(gè)月隨訪1次，此后每6個(gè)月隨訪1次。隨訪期間常規(guī)行影像學(xué)、生化以及腫瘤標(biāo)志物檢查。總生存時(shí)間（overall survival，OS）定義為L(zhǎng)T至患者死亡的時(shí)間；對(duì)于中途失訪者，則為L(zhǎng)T至最后1次隨訪的時(shí)間。無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（recurrence-free survival，RFS）定義為L(zhǎng)T至腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間；對(duì)于中途失訪或死亡者，則為L(zhǎng)T至最后1次隨訪的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存率的差異。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行單因素和多因素分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果178例患者的KLI為1%～80%，中位數(shù)為20%，將患者分為Ki67高表達(dá)組（KLI＞20%，85例）和Ki67低表達(dá)組（KLI≤20%，93例），見圖1。

Fig.1 The expression of Ki67 in liver cancer tissues detected by immunohistochemistry(×400)圖1免疫組化檢測(cè)Ki67在肝癌組織中的表達(dá)（×400）

2.2 Ki67的表達(dá)與HCC患者臨床及病理特征的關(guān)系2組患者的年齡、性別、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤最大直徑、衛(wèi)星灶、AST、ALT、TB、ALB、WBC、HGB、PLT、INR、PT以及MELD評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高表達(dá)組患者術(shù)前血清AFP水平、微血管侵犯以及低分化的比例均高于低表達(dá)組（P＜0.05），見表1。

2.3 Ki67的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Ki67高表達(dá)組患者術(shù)后1、3、5年總體OS分別為78.7%、52.6%、39.5%，低于Ki67低表達(dá)組（86.5%、76.3%、76.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=9.016，P＜0.01），見圖2。高表達(dá)組患者1、3、5年RFS分別為47.9%、34.7%、32.0%，亦低于低表達(dá)組（84.4%、77.5%、72.4%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=28.467，P＜0.01），見圖3。

Tab.1 Comparison of clinicopathological data between the two groups表1 2組患者臨床病理資料比較

Fig.2 Comparison of overall survival between two groups of patients after liver transplantation圖2 2組患者肝移植術(shù)后OS比較

Fig.3 Comparison of recurrence-free survival between two groups of patients after liver transplantation圖3 2組患者肝移植術(shù)后RFS比較

2.4 單因素及多因素Cox回歸分析 變量賦值方法，見表2。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，多個(gè)腫瘤、腫瘤最大直徑＞5 cm、有衛(wèi)星灶、有微血管侵犯、腫瘤低分化、術(shù)前血清AFP＞400 μg/L以及KLI＞20%是影響患者RFS的危險(xiǎn)因素，見表3。其中多個(gè)腫瘤、腫瘤最大直徑＞5 cm、有微血管侵犯、腫瘤低分化、術(shù)前血清AFP＞400μg/L以及KLI＞20%是影響患者OS的危險(xiǎn)因素，見表4。

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Cox回歸分析，在納入的7個(gè)變量中，腫瘤直徑＞5 cm、有微血管侵犯、術(shù)前血清AFP＞400μg/L以及KLI＞20%是影響患者術(shù)后RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表5。在納入的6個(gè)變量中，有微血管侵犯、術(shù)前血清AFP＞400 μg/L是影響患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表6。

Tab.2 Variable assignment表2變量賦值情況

Tab.3 Univariate Cox regression analysis on recurrencefree survival of patients表3影響患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存的單因素Cox回歸分析

Tab.4 Univariate Cox regression analysis on overall survival of patients表4影響患者術(shù)后生存的單因素Cox回歸分析

Tab.5 Multivariate Cox regression analysis on recurrence-free survival of patients表5影響患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存的多因素Cox回歸分析

Tab.6 Multivariate Cox regression analysis on overall survival of patients表6影響患者術(shù)后生存的多因素Cox回歸分析

3 討論

腫瘤的增殖狀態(tài)是反映腫瘤生物學(xué)特性的重要參數(shù)，與腫瘤的治療效果以及患者的預(yù)后直接相關(guān)［8］。Ki67蛋白存在于細(xì)胞周期的所有活躍階段，可以有效反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，因此它被認(rèn)為與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)［9-10］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌［11］、肺癌［12］、食管癌［13］、胰腺癌［14］、星形細(xì)胞瘤［15］、胰腺內(nèi)分泌腫瘤［16］以及垂體腺瘤［17］等多種癌癥中，腫瘤組織Ki67高表達(dá)的患者預(yù)后往往較差。但關(guān)于Ki67的表達(dá)與HCC患者肝移植術(shù)后預(yù)后關(guān)系的研究較少。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，Ki67的表達(dá)與HCC的增殖和惡性生物學(xué)活性有關(guān)，并且Ki67高表達(dá)的肝癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，相比治愈組，Ki67在肝癌復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)更高；Ki67的高表達(dá)與肝癌患者根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)以及較低的總體生存率相關(guān)［19-20］。張彥等［21］通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織Ki67的表達(dá)與HCC患者的AFP水平以及門靜脈轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且Ki67在正常肝組織及高、中、低分化組織中的表達(dá)強(qiáng)度呈增加趨勢(shì)。Zhang等［18］也發(fā)現(xiàn)肝癌組織Ki67陽性與LT術(shù)后HCC復(fù)發(fā)相關(guān)，但沒有給出用于區(qū)分Ki67表達(dá)高低的截?cái)嘀怠?/p>

本研究以患者KLI的中位數(shù)（20%）作為區(qū)分Ki67表達(dá)高低的截?cái)嘀担Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki67的表達(dá)與肝細(xì)胞癌肝移植患者的預(yù)后有關(guān)。高表達(dá)組患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率均低于低表達(dá)組。多因素分析顯示，Ki67高表達(dá)是影響患者肝移植術(shù)后RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)，高表達(dá)組患者的術(shù)前血清AFP水平、微血管侵犯以及低分化的發(fā)生率要高于低表達(dá)組。與Ki67低表達(dá)的腫瘤相比，Ki67高表達(dá)的腫瘤往往增殖活躍，更容易對(duì)周圍組織產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移［9-10］。韓帥等［22］發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)與HCC脈管癌栓、血清AFP水平、腫瘤分化程度以及復(fù)發(fā)有關(guān)。Luo等［23］的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果表明，Ki67高表達(dá)與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移以及靜脈侵犯有關(guān)，并且Ki67高表達(dá)患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率較低。值得注意的是，在乳腺癌中，KLI≥20%也被認(rèn)為是Ki67的高表達(dá)狀態(tài)［24］。

總之，本研究表明Ki67高表達(dá)的肝癌肝移植患者預(yù)后較差，并且Ki67的表達(dá)與患者術(shù)前血清AFP水平、腫瘤分化以及微血管侵犯有關(guān)；腫瘤組織Ki67可以作為預(yù)測(cè)肝癌肝移植患者預(yù)后的一個(gè)潛在指標(biāo)。考慮到本研究為單中心、回顧性研究，且樣本量有限，因此結(jié)果可能具有一定的局限性，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。