多功能層狀雙氫氧化物納米復合材料的制備及其體外抗腫瘤性能

葉玉函， 張紅梅， 陳 霞， 朱利民

(東華大學 化學化工與生物工程學院， 上海 201620)

長期以來，化療一直是癌癥的首選治療方法。然而，傳統化學治療劑的靶向性差，容易從體內被清除并且具有嚴重的毒副作用。為了解決這些困難，人們廣泛探索了納米載體在化療中的應用，通過包封或者吸附等手段將藥物小分子整合于納米材料中形成新型藥物遞送系統(drug delivery systems, DDSs)，實現藥物的有效傳遞[1-2]。

在過去的幾十年里，二維納米材料由于其獨特的理化性質在生物醫學領域引起了極大的關注，如超薄結構的氧化石墨烯[3]、黑磷[4]、過渡金屬二鹵化物[5]等都被用作藥物載體。然而這些二維納米材料通常存在制備難度大、負載能力有限或生物相容性差等問題，在靶向DDSs中的應用受到限制。因此，在二維材料合成和探索的基礎上，尋找一種生物相容性高、易于改性且具有高負載量的材料成為一種挑戰。

在上述研究的基礎上，擬采用水熱法制備層狀雙氫氧化物納米片(LDH NSs)，然后在LDH NSs的表面修飾改性聚乙二醇(PEG)，通過酰胺化反應引入靶向肽B3int制備功能化層狀雙氫氧化物納米片(LDH-PEG-B3int NSs)。將不同質量濃度的阿霉素(DOX)和光熱劑吲哚菁綠(ICG)與LDH-PEG-B3int NSs共混，通過物理吸附成功構建載藥復合物(DOX-ICG@LDH-PEG-B3int)。期望通過以上安全、簡便的方法合成具有良好生物相容性、化療與光熱治療相結合、主動靶向腫瘤的多功能LDH納米復合材料。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與儀器

六水合硝酸鎂Mg(NO3)2·6H2O、九水合硝酸鋁Al(NO3)3·9H2O、無水乙醇、氫氧化鈉(NaOH)，國藥集團化學試劑有限公司；氨基化PEG，上海亞亦生物科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二甲基亞砜(DMSO)、戊二醛，阿拉丁生化科技股份有限公司；DOX、ICG，上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸緩沖鹽(PBS)溶液、DMEM高糖培養基、1640不完全培養液、雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清，美國Gibco公司；Calcein-AM/PI試劑盒、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，江蘇凱基生物技術股份有限公司；小鼠黑色素瘤細胞(B16)、小鼠成纖維細胞(3T3)，中國科學院生物化學與細胞生物學研究所；其余藥品和透析袋均購自國藥集團化學試劑有限公司。所用藥品均為分析純。所用水均為Milli-Q Plus 185凈水系統純化所得超純水。

高速離心機(TG16A型，離心半徑(R)為32.5 mm，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；電子分析天平(GL124-1SCN型，上海精科儀器有限公司)；磁力攪拌器(C-MAGHS10 型，德國 IKA 公司)；馬弗爐(上海慧泰儀器制造有限公司)；掃描電子顯微鏡(TM-1000型，日本日立公司)；超聲波清洗機(SCQ-5201C1型，上海聲彥超聲波儀器有限公司)；冷凍干燥機(FD-1D-50型，北京博醫康實驗試劑有限公司)；紫外可見分光光度計(UV3600 型，日本島津公司)；熱重分析儀(CLARUS SQ8-STA8000型，美國珀金埃爾默公司)；酶標儀(MK3型，普朗醫療器械公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000 型，日本奧林巴斯有限公司)；倒置熒光顯微鏡(DM IL LED型，德國Leica公司)；Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 LDH NSs的制備

采用水熱法制備LDH NSs。將0.544 g NaOH溶于60 mL超純水中，將1.538 g Mg(NO3)2·6H2O和0.75 g Al (NO3)3·9H2O的混合物溶于40 mL超純水中，然后將該溶液逐滴滴加到前述NaOH溶液中。在氮氣氣氛下以400 r/min的轉速攪拌30 min，離心(轉速為11 000 r/min,R=32.5 mm)收集產物并用超純水洗滌3次，分散在70 mL超純水中。隨后在100 ℃的高壓釜中水熱放置16 h后獲得LDH NSs。

1.2.2 LDH-PEG NSs的制備

將10 mg H2N—PEG—NH2、2 mg LDH NSs分散在裝有10 mL水溶液的棕色試劑瓶中，超聲30 min使其分散均勻后再磁力攪拌12 h，得到的混合溶液在13 000 r/min的轉速下離心(R=32.5 mm)15 min收集沉淀，冷凍干燥得到LDH-PEG NSs。

1.2.3 LDH-PEG-B3int NSs的制備

稱量20 mg LDH-PEG NSs溶解于裝有10 mL PBS溶液(pH=7.4)的小燒杯中，向其中加入11.4 mg EDC和6.9 mg NHS 并超聲15 min，然后向溶液中加入10 mg B3int，在室溫下攪拌12 h。反應后的溶液在13 000 r/min的轉速下離心(R=32.5 mm)后收集沉淀，冷凍干燥，得到LDH-PEG-B3int NSs。

1.2.4 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的制備

取10 mg LDH-PEG-B3int NSs溶解于pH=7.4的PBS溶液中，再取10 mg DOX溶解于DMSO中，迅速將二者混合，避光條件下磁力攪拌24 h。然后用截留分子量為3.5 kDa的透析袋對混合溶液透析3 d以純化，收集產物DOX@LDH-PEG-B3int納米顆粒備用。同時制備DOX@LDH-PEG作為對照組。取10 mg ICG完全溶于DMSO后與10 mg DOX@LDH-PEG-B3int混合并攪拌24 h，然后將混合溶液倒入截留分子量為3.5 kDa的透析袋中透析以除去未負載的ICG，收集產物冷凍干燥得到DOX-ICG@LDH-PEG-B3int。DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的合成示意圖如圖1所示。用同樣的方法制備ICG@LDH-PEG-B3int。

1.2.5 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的載藥性測定

用PBS溶液配制不同質量濃度(2.5、4.0、5.0、7.5、10.0 μg/mL)的DOX溶液，用紫外-可見分光光度計測定λ=490 nm處溶液的吸光度并繪制DOX溶液吸光度-質量濃度標準曲線(y=0.041 6x+0.035 8，R2=0.999 7)。

取DOX-ICG@LDH-PEG-B3int粉末充分溶解于超純水，以10 000 r/min離心(R=32.5 mm)20 min，收集上清液，用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，再根據標準曲線計算復合材料中DOX的含量，并根據式(1)和(2)分別計算材料的載藥率(L)和包封率(E)。

(1)

(2)

式中：m0為DOX的投藥量，mg；m1為上清液中DOX的質量，mg；m為載藥納米顆粒的總質量，mg。

1.2.6 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的釋藥性測定

探索pH值和NIR對藥物體外釋放的影響。分別稱取2 mg DOX-ICG@LDH-PEG-B3int凍干粉末溶于2 mL不同pH值(pH=5.0, 7.4)的PBS溶液中，將上述溶液分別裝入4個截留分子量為3.5 kDa的透析袋中，再準備4個50 mL的離心管，將上述透析袋放入其中，分別標記為pH=5.0、pH=5.0+NIR、pH=7.4、pH=7.4+NIR，每個離心管中加入18 mL相應pH值的PBS溶液。在不同的時間點(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h)取透析袋外部的溶液各1 mL，并補充相應pH值的PBS溶液1 mL。用紫外-可見分光光度計測定所取溶液的吸光度并代入DOX標準曲線方程，計算不同時間點釋放的DOX量。所有試驗均重復3次。

1.3 材料表征

1.3.1 表面形貌

分別配制質量濃度為0.5 g/L的LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液，將溶液滴在硅片上自然晾干，用掃描電子顯微鏡觀察其形貌。使用圖像分析軟件ImageJ采集100片不同納米片并測量納米片直徑，然后用Origin軟件對測得的數據進行分析，以獲得納米片平均直徑及其分布。

1.3.2 熱重分析

在氮氣氣氛下使用1～5 mg樣品以10 ℃/min的速率從50 ℃加熱到500 ℃進行熱重分析。

1.3.3 紫外-可見吸收光譜分析

分別取用PBS溶液溶解的質量濃度為0.05 g/L的DOX、ICG、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液各800 μL，超聲10 min使其充分溶解，然后進行紫外光譜掃描以確定DOX和ICG的成功加載。

1.3.4 Zeta電勢分析

分別配置質量濃度為0.5 g/L的LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液，超聲10 min使其分散均勻后各取800 μL于比色皿中，用Zeta電位分析儀測量不同樣品的Zeta電位。

1.4 體外細胞攝取

將B16細胞和3T3細胞分別接種于共聚焦培養皿中(2×105個)，在細胞培養箱(37 ℃，5% CO2)中培養24 h，棄去培養基，用PBS溶液清洗3次，分別加入一定體積含游離DOX、DOX@LDH-PEG、DOX@LDH-PEG-B3int溶液(DOX的最終質量濃度為5 μg/mL)的新鮮培養液并且設置PBS溶液作為對照組。孵育4 h后棄去培養基，用PBS溶液清洗3次。最后，將細胞用質量分數為2.5%的戊二醛水溶液在4 ℃固定15 min。用DAPI對細胞核進行染色后用PBS溶液多次洗滌(避光條件下)，隨后用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)記錄圖像。

1.5 體外細胞毒性

使用MTT比色法檢測DOX-ICG@LDH-PEG-B3int藥物遞送系統對B16細胞的殺傷作用。將B16細胞以1×104個/孔的密度接種于含1640完全培養液(10%胎牛血清、1%雙抗、89% 1640不完全培養液)的96孔板中，培養24 h后棄去該培養基，用PBS溶液洗滌3次后每孔加入100 μL不同的樣品溶液，再補加100 μL 1640完全培養液。設置4組不同的治療組：(1)游離DOX；(2)ICG+NIR；(3)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int；(4)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR。對于NIR激光照射組，孵育12 h后，用激光功率密度為2.0 W/cm2的808 nm NIR激光照射5 min。繼續培養12 h后棄去培養基，用PBS溶液清洗3次，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，在黑暗中孵育4 h后，向每個孔中添加200 μL DMSO，15 min后通過酶標儀測定在570 nm下細胞吸光密度(optical density, OD)。每組樣品設置5個復孔，每個樣品平行測定3次。細胞存活率計算如式(3)所示。

細胞存活率=(試驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%

(3)

同樣采用MTT比色法來檢測DOX-ICG@LDH-PEG-B3int藥物遞送系統的生物相容性。將3T3細胞接種于含DMEM高糖培養基的96孔板中，每孔細胞為104個。用游離DOX、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int組處理3T3細胞。培養24 h后棄去培養基，用PBS溶液清洗3次，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，在黑暗中孵育4 h后，向每個孔中添加200 μL DMSO，15 min后用酶標儀記錄細胞在570 nm下的OD值并按照式(3)計算細胞存活率。每組樣品設置5個復孔，每個樣品平行測定3次。

采用calcein-AM/PI雙染色法更直觀地評估各材料的體外抗腫瘤效果。將B16細胞接種于6孔板，每孔細胞為2×105個。培養24 h后棄去培養基并用PBS溶液沖洗3次，每孔分別加入1 mL不同材料(每種材料添加的質量濃度根據最終DOX的半數致死量而定)，再補加1 mL 1640完全培養液。根據治療方式的不同設為6組：(1)PBS溶液對照組；(2)游離DOX；(3)ICG+NIR；(4)ICG@LDH-PEG-B3int+NIR；(5)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int；(6)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR。對于NIR激光照射組，孵育12 h后每孔用808 nm NIR激光(功率密度為2.0 W/cm2)照射10 min后繼續培養12 h。溫育后，將細胞用PBS溶液洗滌3次，加入500 μL calcein-AM(2 μmol/L)和PI(8 μmol/L)的混合溶液進行染色。30 min后，將細胞用PBS溶液洗滌3次，然后用倒置熒光顯微鏡采集細胞圖像。

2 結果與討論

2.1 材料的制備與性質

2.1.1 LDH NSs 及其復合物的表觀形貌

層狀雙氫氧化物及其納米復合物的SEM圖及納米片直徑分布如圖2所示。由圖2可知，LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有典型的層狀雙氫氧化物六邊形形貌，通過ImageJ和Origin軟件分析其平均直徑分別為69.64、74.53、77.68 nm，說明B3int的修飾以及DOX和ICG的加載不會顯著影響LDH NSs的大小和形貌。

圖2 LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的SEM和納米片直徑分布圖

2.1.2 熱重分析

LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs的TGA熱分析結果如圖3所示。由圖3可知，LDH NSs的熱分解過程可分為以下3個階段：第一階段，溫度小于200 ℃時，LDH NSs失去層間水，層間距變小；第二階段，溫度在200～400 ℃時，繼續失去層間水，碳酸根離子此時開始分解，LDH NSs結構改變，形成復合金屬氧化物；第三階段，溫度在400～500 ℃時，大部分碳酸根轉化為CO2，完全失去水分，形成強堿性的金屬化合物。LDH NSs加熱到500 ℃時失重率為40.63%，而LDH-PEG NSs和LDH-PEG-B3int NSs的失重率分別為42.54%和77.23%，這主要歸功于PEG和B3int在溫度50～500 ℃內發生的熱解，從而證實PEG和B3int的成功連接。

圖3 LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs的TGA熱分析圖

2.1.3 紫外-可見吸收光譜分析

DOX、ICG、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的紫外-可見吸收光譜圖如圖4所示。由圖4可以看出，DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在λ=480 nm處顯示特征性DOX吸收峰，而在λ=795 nm處顯示特征性ICG峰，表明其已成功加載了DOX和ICG。

圖4 DOX、ICG和DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的紫外-可見光吸收光譜

2.1.4 Zeta電勢分析

在藥物遞送系統制備過程中，可以通過分析各中間體的Zeta電勢變化判斷材料是否被成功修飾。DOX-ICG@LDH-PEG-B3int制備過程中各中間體和最終材料的Zeta電勢如圖5所示。由圖5可知，LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的Zeta電勢分別為 39.5、28.5、-12.7、24.1和12.6 mV。LDH NSs經PEG修飾以后的Zeta電勢由39.5 mV降低為28.5 mV，表明LDH-PEG NSs的成功制備。LDH-PEG NSs接枝呈負電荷的B3int后，其Zeta電勢由28.5 mV變為負值(-12.7 mV)，表明B3int成功連接。負載DOX以后的DOX@LDH-PEG-B3int的Zeta電勢由負值上升至24.1 mV，電勢的明顯變化證明DOX已成功吸附到LDH-PEG-B3int NSs上。負載ICG后的電勢較DOX@LDH-PEG-B3int降低了11.5 mV，進一步表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的成功制備。

圖5 LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的電勢分析圖

2.2 載藥率、包封率及藥物釋放測試

將載藥試驗測得上清液中DOX的吸光度代入DOX的標準曲線中，并根據式(1)和(2)計算得出DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的載藥率和包封率分別為18.62%和89.62%。

DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在有、無NIR激光照射和不同pH值下的藥物釋放曲線如圖6所示。

圖6 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在不同pH值和有、無NIR激光照射下的DOX累計釋放曲線

由圖6可知，在72 h內，沒有NIR激光存在時，pH=5.0和pH=7.4條件下DOX累計釋放率分別為53.9%和32.1%。酸性條件下釋藥量增大，這可能是因為DOX中氨基質子化增加，并且與LDH-PEG-B3int NSs的靜電相互作用減弱，促進藥物的釋放，該特性有利于復合物在腫瘤內環境靶向釋放藥物。在NIR激光存在下，DOX累計釋放率高于相同pH值條件下的藥物釋放率。這可能是因為ICG產生的高溫使DOX與復合材料之間的結合變弱進而加速藥物的釋放。由此表明制備的DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有pH和NIR雙重響應特性。

2.3 體外細胞攝取分析

通過激光掃描共聚焦顯微鏡記錄PBS溶液對照組、游離DOX組、DOX@LDH-PEG組和DOX@LDH-PEG-B3int組分別在B16(圖7(a))和3T3(圖7(b))細胞中的攝取情況。由圖7可知：用游離DOX處理過的B16細胞和3T3細胞都有DOX的紅色熒光，這是因為游離的DOX不具備靶向性能，其能被兩種細胞攝取；而經DOX@LDH-PEG處理過的B16細胞的紅色熒光強度大于3T3細胞，這是因為DOX@LDH-PEG通過增強滲透滯留效應更多地聚集在B16細胞中；DOX@LDH-PEG-B3int組處理過的B16細胞的紅色熒光強度大于3T3細胞，主要是因為靶向肽B3int與整合素αvβ3的特異性結合，導致B16細胞吸收的DOX@LDH-PEG-B3int遠遠多于3T3細胞。結果表明制備的納米復合材料DOX@LDH-PEG-B3int具有良好的靶向性。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別為PBS溶液對照組、游離DOX、DOX@LDH-PEG和DOX@LDH-PEG-B3int;藍色熒光：DAPI標記的細胞核；紅色熒光：DOX。

2.4 體外細胞毒性及細胞相容性分析

B16細胞經MTT處理后得到的細胞存活率如圖8所示。由圖8可知，經DOX-ICG@LDH-PEG-B3int處理后細胞存活率顯著下降并且降幅大于游離DOX組，主要原因是B3int具有靶向性，能幫助抗癌藥物DOX到達腫瘤細胞。此外，在DOX質量濃度為15 μg/mL時，經DOX-ICG@LDH-PEG-B3in處理的細胞存活率為32.7%，而經DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR協同治療組處理的細胞存活率僅為25.0%，且在各個DOX質量濃度下協同治療組的細胞存活率均為最低，這主要歸因于光熱治療/化療聯合治療提供的協同作用。

圖8 游離DOX、ICG+NIR、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR對B16的細胞毒性分析圖

用正常細胞評價材料的生物相容性結果如圖9所示。由圖9可知，除了游離DOX組處理的3T3細胞存活率隨DOX質量濃度的增大而顯著下降外，其他兩組的細胞存活率均大于90%。由此說明，所制備的載藥納米復合物DOX-ICG@LDH-PEG-B3int對正常細胞的毒性很小，可忽略不計。

圖9 游離DOX、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@ LDH-PEG-B3int對3T3細胞的毒性分析圖

采用Calcein-AM/PI雙染色法觀察各治療組的抗腫瘤效果，結果如圖10所示，其中，活細胞為綠色，死細胞為紅色。由圖10可知，化療聯合光熱治療組(DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR)的細胞死亡最多。這說明LDH可以作為優良的藥物載體，負載靶向肽B3int和化療藥物DOX的同時加載光熱劑ICG，在促進腫瘤凋亡方面具有良好的治療效果。

圖10 不同配方治療細胞Calcein-AM/PI雙染色的熒光圖像

3 結 語

本文成功制備層狀雙氫氧化物藥物遞送系統DOX-ICG@LDH-PEG-B3int，具有規則的六邊形形貌，終產物平均直徑為77.68 nm，載藥率為18.62%，包封率為89.62%。體外藥物釋放試驗表明制備的藥物遞送系統具有pH、NIR雙重刺激響應性藥物釋放特性。通過LSCM證明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有靶向癌細胞的能力且不會停留在正常細胞，能夠選擇性殺傷癌細胞。通過MTT和Calcein-AM/PI雙染色法表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int對癌細胞具有殺傷作用而對正常細胞幾乎無毒。ICG產生的熱量和DOX均能殺死癌細胞，二者聯合使用可提高殺傷效率，實現良好的協同治療效果，表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int有望進一步用于體內治療。