Fe-EDDHA 矯治梨缺鐵黃化病應用效果研究*

郭獻平，郭鵬，王東升，蔣卉，吳中營，韓永平，智夢茹

（1 河南省農業科學院園藝研究所，鄭州450002）（2 河南農業大學園藝學院）

鐵是參與植物體內氧化還原反應的重要元素，與葉綠素合成和光合作用密切相關。在干旱、半干旱的石灰性土壤上，pH 值較高，富含游離碳酸鈣，作物缺鐵現象非常普遍[1-2]。在不同地區，東方梨和西洋梨均有報道梨樹缺鐵黃化病[3-6]。缺鐵會導致梨樹葉片葉綠素含量下降，葉脈間萎黃，降低光合作用，果實產量降低，甚至樹體死亡[7-8]。生產上通常施用各種鐵肥矯治梨樹缺鐵黃化病，包括無機鐵肥、螯合鐵肥、有機復合鐵肥等[9]。采用的方式有土壤施用、葉面噴施及樹干注射等[10]。土施方面，在石灰性土壤上施可溶性無機鐵肥（如FeSO4·7H2O），因氧化作用及土壤堿性作用最終會轉化為氫氧化鐵，即使增加鐵肥施用量，其效果仍不是很理想[11]；有機復合鐵肥（如木質素磺酸鐵）雖然易降解，但矯治作物缺鐵的效果不如螯合鐵肥。螯合鐵肥一般源于對鐵有高度親和力的有機酸與無機鐵鹽中Fe3+螯合而成，常見螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺二鄰羥苯基乙酸（EDDHA）等[9]。研究表明，螯合劑螯合鐵的能力與pH 值相關性強，隨著溶液pH 值增高，螯合能力從小到大依次為EDTA、DTPA、EDDHA。pH 值高于6.7，鐵可從Fe-EDTA 中被置換，pH 值高于7.7，鐵可從Fe-DTPA 中被置換，而Fe-EDDHA 幾乎不受pH 值影響[12]。因此，EDDHA 被廣泛作為生產螯合鐵肥的螯合劑。

目前，土施Fe-EDDHA 在柑橘[13]、桃[14]、獼猴桃[15]等果樹上均有防治缺鐵黃化病的應用。在石灰性土壤條件下，土施Fe-EDDHA 在梨樹上的應用較少。本研究以5 年生缺鐵黃化新高梨和1 年生水培黃化杜梨苗為研究對象，土施不同用量無機鐵肥FeSO4·7H2O 和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），果實成熟時測定新高梨葉片葉綠體色素、微量元素含量和果實品質，并通過在水培黃化杜梨苗溶液中加入FeSO4·7H2O 和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），測定杜梨葉片葉綠素含量和光合指標、根系活性鐵等微量元素含量及鐵吸收關鍵基因的表達量變化，探究Fe-EDDHA 矯治梨樹缺鐵黃化病的應用效果，及其促進梨樹復綠的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為5 年生缺鐵黃化新高梨和1 年生水培黃化杜梨苗。5 年生結果初期新高梨種植于河南省蘭考縣谷營鎮霍寨村梨園，砧木為杜梨，面積約3 hm2，南北行向，行株距4 m×2 m，樹高2.6 m，主干粗6.2 cm。園區土壤為沙壤土，pH 值8.7，有機質含量0.9%，堿解氮含量46.8 mg/kg，有效磷含量16.6 mg/kg，速效鉀含量138.1 mg/kg，有效鐵含量8.4 mg/kg，CaCO3含量114.90 g/kg，HCO3-含量0.32 g/kg。

杜梨幼苗種植在河南現代農業研究開發基地梨示范園溫室大棚內，當幼苗長出5～7 片真葉后，選擇高度均一的幼苗移至水培槽培養，營養液為含1×10-4mol/L Fe-EDTA［A600437，生工生物工程（上海）股份有限公司］的改良Hoagland 營養液，pH 值約6.5[16]。1 周后，移至加有2 mmol/L NaHCO3、0.5 g/L CaCO3、1×10-6mol/L Fe-EDTA 的100 L 改良Hoagland 營養液中，pH 值7.5 左右，模擬石灰性土壤條件，培養30 d 獲得杜梨黃化苗[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理

5 月新高梨出現缺鐵黃化病后，選擇黃化程度基本相同、樹勢一致、有代表性的梨樹作為試材。試驗采用土施無機鐵肥［FeSO4·7H2O，生工生物工程（上海）股份有限公司］和螯合鐵肥（Fe-EDDHA含量＞6%，四川瑞隆螯合肥科技有限公司）的方法，設置5 個處理：T1，株施無機鐵肥（FeSO4·7H2O）5 g；T2，株施無機鐵肥（FeSO4·7H2O）15 g；T3，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g；T4，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g；以不施鐵肥為對照（CK1），每個處理3 株樹。處理方法是在距離主干50 cm 挖寬15～20 cm 的環狀溝，用10 L 灌溉水溶解鐵肥后均勻地澆入溝內，滲完后用土回填，對照用同等量的水。2 周后，按照同樣方法和用量再施1 次。最終，T1、T2 處理分別株施無機鐵肥（FeSO4·7H2O）10、30 g，T3、T4 處理分別株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）10、30 g。處理125 d 果實成熟時，測定葉片葉綠體色素、微量元素含量，各指標每株選取代表性葉片3 片混合測定；從每株樹不同方位選取6 個果實測定果實品質。

選擇長勢、黃化程度相近的杜梨苗移至20 L 不同鐵肥的Hoagland 營養液中，設置3 個處理：T5、T6 分別是含1×10-6mol/L FeSO4·7H2O、1×10-6mol/L Fe-EDDHA 的Hoagland 營養液；對照（CK2）是含1×10-6mol/L Fe-EDTA 的原營養液。3 個處理營養液中均含2 mmol/L NaHCO3和0.5 g/L CaCO3，每個處理6株，共處理15 d。選擇3個處理初始SPAD值相近的葉片10片，每隔5 d 測定葉片SPAD 值；15 d 后測定葉片光合指標，并取部分根系轉至液氮中速凍，置于-80 ℃冷凍保存備用，剩余根系測定微量元素。

1.2.2 測定指標與方法

每個處理稱取0.2 g 剪碎的新高梨葉片，用96%乙醇提取，用上海佑科UV756 紫外可見分光光度計測定葉綠體色素提取物在665、649、470 nm 處的吸光度值，以96%乙醇為空白，測定總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，參照Lichtenthaler等[18]的方法計算。杜梨葉片SPAD 值利用SPAD-502便攜式葉綠素測定儀測定。

活性鐵、活性銅、活性鋅、活性錳含量采用酸消解ICP 法測定[19-20]。新高梨葉片或杜梨根系在105 ℃殺青30 min，然后在70 ℃條件下烘干7 d至恒重后，稱取干燥葉片或根系0.1 g，加入10 mL的1.0 mol/L 鹽酸浸提，連續振蕩24 h，過濾后用ICP法測定浸提液中的活性鐵、活性銅、活性鋅、活性錳含量。

取新高梨葉片0.5 g 于瓷坩堝中，在電爐中低溫碳化（至不冒煙），再移至高溫電爐中緩緩升溫，至500 ℃灼燒2～3 h，冷卻后用10～20 mL 鹽酸溶液溶解灰分，并定容至25 mL，用ICP 法測定浸提液中全硼、全銅、全鋅、全錳含量。

用天平稱量單果重，用托普云農GY-4 硬度計測定果肉硬度，用Atago PAL-1 數顯糖度計測定可溶性固形物含量，可滴定酸含量按照GB 12456—2021 的方法測定，維生素C 含量按照GB 5009.86—2016 的2,6-二氯靛酚滴定法測定，并計算固酸比。

采用漢莎光合作用測定儀（CIRAS-3）測定葉片光合指標，包括凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE）。

在NCBI 中獲得杜梨三價鐵還原酶基因PbFRO2和二價鐵轉運蛋白基因PbIRT1cDNA 全長的基礎上，利用Primer 5.0 設計實時熒光定量PCR引物，以Actin為內參基因，PbActinQ-F：5′-CTTCCC GATGGCCAAGTCAT-3′，PbActinQ-R：5′-CATGAAT GCCAGCAGCTTCC-3′，PbFRO2Q-F：5′-CTCTTCG GTTCTGGCACTGT-3′，PbFRO2Q-R：5′-GGCCATG AGCTGTGAAGAGT-3′，PbIRT1Q-F：5′-GCCAAGGG AGAAAACGGAGA-3′，PbIRT1Q-R：5′-AGCGCAG CTACAAGACCTTT-3′。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

將-80 ℃保存的杜梨幼苗根系取出，用總RNA提取試劑盒R1200（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，用Thermo Fermentas反轉錄試劑盒K1622（美國）反轉錄獲得cDNA。實時熒光定量PCR 反應體系參照南京諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green Master Mix 試劑盒，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 個循環。采用2-△△CT法進行表達量分析。

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0 進行統計學分析，用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析，利用Excel 進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對新高梨葉片葉綠體色素含量的影響

由表1 可知，施用鐵肥125 d后，新高梨葉片總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量由高到低均為T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，其中T1 和T2 處理的葉片總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量與CK1 均無顯著差異；T3 處理的葉片部分復綠，其總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別較CK1 顯著增加了98.0%、94.7%、108.3%、92.3%；T4 處理的葉片完全復綠，其總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別較CK1 顯著增加了542.0%、521.1%、608.3%、423.1%。此外，T2 處理的葉綠素a、類胡蘿卜素含量與T3 處理均無顯著差異，總葉綠素、葉綠素b含量均顯著低于T3 處理。T4 處理的葉綠體色素含量均顯著高于T1、T2 和T3 處理。

表1 不同處理新高梨葉片葉綠體色素含量 mg/g

2.2 不同處理對新高梨葉片微量營養元素的影響

施用鐵肥125 d后，各處理葉片活性鐵含量由高到低為T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，而葉片全硼、全銅、全鋅含量與活性鐵相反，葉片全錳含量由高到低為T1＞CK1＞T2＞T3＞T4。T2、T3、T4 處理的葉片活性鐵含量分別比CK1 顯著提高了75.6%、148.9%、251.4%，T1 處理與CK1 無顯著差異。T2、T3、T4 處理的葉片全硼、全錳含量分別比CK1 顯著降低了21.3%、33.3%、39.3%和7.7%、9.9%、33.7%，T1 處理與CK1 均無顯著差異，T2 和T3 處理間均無顯著差異。4 個鐵肥處理的葉片全銅、全鋅含量均顯著降低，分別較CK1 降低了10.2%、34.8%、44.1%、50.4%和8.0%、24.9%、35.9%、38.1%，T3 和T4 處理間均無顯著差異（表2）。

表2 不同處理新高梨葉片微量營養元素含量

2.3 不同處理對新高梨果實品質的影響

由表3 可以看出，T1、T2 處理的單果重、果肉硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比和維生素C 含量與CK1 均無顯著差異。T3 處理的可溶性固形物含量、固酸比分別較CK1 顯著提高了7.9%和13.5%，單果重、果肉硬度、可滴定酸含量和維生素C 含量與CK1 均無顯著差異。T4 處理的單果重、可溶性固形物含量、固酸比分別較CK1 顯著提高了22.1%、15.3%和38.2%，果肉硬度、可滴定酸含量分別較CK1 顯著降低了8.9%和15.9%，維生素C 含量與CK1 無顯著差異。T1、T2 處理的單果重、果肉硬度、可滴定酸含量、固酸比和維生素C 含量與T3 處理均無顯著差異，可溶性固形物含量顯著低于T3 處理。

表3 不同處理新高梨果實品質

2.4 不同處理對杜梨葉片SPAD 值的影響

如圖1 所示，杜梨幼苗在模擬石灰性土壤條件的Hoagland 營養液中處理15 d 期間，CK2 的葉片SPAD 值呈下降趨勢，T5 處理的葉片SPAD 值與CK2相比無顯著變化。T6 處理的葉片SPAD 值呈上升趨勢，且在處理前5 d 上升幅度最大，第5、10、15 d的SPAD 值均顯著高于T5 處理和CK2。在處理第15 d時，T6 處理的葉片已復綠，其SPAD 值較T5 處理顯著提高了113.7%，較CK2 顯著提高了146.6%。

圖1 不同處理不同時期杜梨葉片SPAD值

2.5 不同處理對杜梨葉片光合指標的影響

由表4 可以看出，杜梨幼苗水培處理15 d后，T5 處理的葉片凈光合速率（Pn）、水分利用率（WUE）與CK2 均無顯著差異，胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均顯著低于CK2。T6 處理的Pn、WUE 分別較CK2 顯著提高了1 034.5%和2 876.9%，分別較T5 處理顯著提高了528.7%、800.0%；T6 處理的Ci 顯著低于CK2和T5 處理，Gs、Tr 均顯著低于CK2，但與T5 處理無顯著差異。

表4 不同處理杜梨葉片光合特性

2.6 不同處理對杜梨根系微量營養元素的影響

水培處理15 d后，各處理杜梨根系活性鐵含量由高到低為T6＞T5＞CK2，而活性銅、活性鋅、活性錳含量與活性鐵含量相反。T5、T6 處理杜梨根系活性鐵含量分別比CK2 顯著提高了71.4%、266.0%，且T6 處理根系活性鐵含量比T5 處理顯著提高了113.6%。T6 處理的活性銅、活性鋅、活性錳含量分別較CK2 顯著降低了76.2%、53.3%和57.5%。T5處理的活性銅含量顯著低于CK2，但其活性鋅、活性錳含量與CK2 均無顯著差異（表5）。

表5 不同處理杜梨根系微量營養元素含量

2.7 不同處理對鐵吸收關鍵基因表達量的影響

由圖2 可知，水培處理15 d后，各處理杜梨根系鐵吸收關鍵基因PbFRO2和PbIRT1的表達量由高到低均為T5＞T6＞CK2，且差異均顯著。T5 處理的PbFRO2相對表達量分別是CK2和T6處理的29.1倍和5.3倍，T6 處理是CK2 的5.4 倍。T5 處理的PbIRT1相對表達量分別是CK2 和T6 處理的349.0倍和3.3倍，T6 處理是CK2 的105.5 倍。

圖2 不同處理第15 d 杜梨根系鐵吸收關鍵基因表達量

3 討論與結論

目前，石灰性土壤面積占世界陸地總面積的30%以上[21]。我國的石灰性土壤分布很廣，約占耕地面積的一半[22]。因此，解決石灰性土壤引起的梨樹缺鐵黃化病具有重要意義。農業行業標準NY/T 1615—2008 中石灰性土壤中CaCO3含量≥10 g/kg。由于的存在，石灰性土壤鐵離子會以Fe2O3的形式被固定[23]。在本研究中，新高梨園區土壤為石灰性土壤，其有效鐵含量僅為8.4 mg/kg，有效鐵含量偏低[24]，從而導致新高梨出現缺鐵黃化病。

本研究中，施用鐵肥125 d后，T4 處理［株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g］的新高梨葉片完全復綠，葉片總葉綠素含量和活性鐵含量分別比對照提高了542.0%和251.4%，單果重和可溶性固形物含量分別比對照提高了22.1%和15.3%；T3 處理［株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）5 g］的葉片未能完全復綠，葉片總葉綠素含量和活性鐵含量分別比對照高98.0%和148.9%，可溶性固形物含量比對照高7.9%；T1 和T2 施用無機鐵肥（FeSO4·7H2O）處理的效果較差，這與Fe-EDDHA 矯治桃和秦美獼猴桃失綠的研究結果一致[14-15]。不同樹種和同一樹種不同樹齡或者冠幅對鐵元素的需求量不同，造成了黃化果樹復綠所需的Fe-EDDHA 用量不同。另外，本研究是在出現缺鐵黃化癥狀之后間隔2 周各施用1 次螯合鐵肥（Fe-EDDHA），而桃樹是在剛萌芽后、獼猴桃在幼葉剛出現時施用，柑橘在春梢始長期和謝花后1周各施用1次[13]。因此，在梨幼樹期、結果初期、盛果期等不同樹齡或者冠幅矯治缺鐵黃化病施用Fe-EDDHA 的用量、次數以及施用的最佳時期還有待進一步研究。

本研究通過在水培黃化杜梨苗的溶液中加入無機鐵肥（FeSO4·7H2O）和螯合鐵肥（Fe-EDDHA），進一步探究Fe-EDDHA 促進梨樹復綠的機理。在模擬石灰性土壤條件的溶液中加入Fe-EDDHA 處理15 d后，杜梨葉片SPAD 值和活性鐵含量分別比對照顯著提高了146.6%和266.0%，而FeSO4·7H2O作用效果較差，與本研究中新高梨應用效果相同。杜梨根系采用機制Ⅰ吸收鐵[25]，本研究T5 處理（1×10-6mol/L FeSO4·7H2O）PbFRO2和PbIRT1的相對表達量分別為T6處理（1×10-6mol/L Fe-EDDHA）的5.3 倍和3.3倍，說明與T6 處理相比，T5 處理還處在缺鐵狀態，導致其鐵吸收關鍵基因的相對表達量較高。植物在缺鐵脅迫后PbFRO2和PbIRT1的相對表達量會呈現先升高后降低的趨勢[16,26]，CK2在獲得杜梨黃化苗時缺鐵處理30 d，在測定基因相對表達量時已缺鐵處理45 d，這可能是CK2 的2 個鐵吸收關鍵基因表達量較T5 和T6 處理低的原因。

缺鐵條件下二價鐵轉運蛋白基因IRT表達量升高，不僅增強轉運鐵的效率，同時也提高了轉運鋅和錳等二價金屬離子的能力，缺鐵脅迫下，擬南芥根系中鋅和錳含量均顯著提高[27]。本研究中，缺鐵條件下，對照和施用無機鐵肥（FeSO4·7H2O）處理的新高梨葉片全硼、全銅、全鋅、全錳含量與杜梨根系活性銅、活性鋅、活性錳含量均高于施用螯合鐵肥（Fe-EDDHA）處理，與張林森等[14]研究結果基本一致。

綜上所述，梨樹結果初期出現缺鐵黃化癥狀之后，株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合鐵肥（Fe-EDDHA）15 g 能夠有效提高石灰性土壤上梨樹葉片活性鐵含量和葉綠體色素含量，提升果實品質，矯治缺鐵黃化病。