轉移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a miR-345水平對預后的預測價值

姜黎麗 馮菲菲 王 偉

直腸癌中以中低位直腸癌(經MRI評估腫瘤下極距離肛緣10 cm以下)占比最高，占直腸癌的70%～75%[1]。中低位直腸癌早期多無明顯癥狀，多數患者確診時已發生其他臟器轉移，喪失手術時機，僅可采用化療、放療為主的姑息治療[2-3]。研究[4-5]發現，轉移性中低位直腸癌患者行同步放化療的療效較好，然而其預后效果仍需要進一步提升。目前，臨床上尚缺乏預測轉移性中低位直腸癌同步放化療預后的有效評價指標，因此，尋求預測轉移性中低位直腸癌同步放化療預后的指標具有重要的臨床意義。微小RNA(MicroRNA，miRNA)為一種非編碼RNA分子，其可與mRNA結合或通過介導切斷靶基因mRNA分子來對靶基因產生抑制作用[6]。研究[7]發現，微小RNA-29a(MicroRNA-29a，miR-29a)與轉移性直腸癌的病情密切相關，且可用于診斷患者是否發生肝轉移。微小RNA-345(MicroRNA-345，miR-345)可預測局部晚期結直腸患者放化療后的療效[8]。然而，目前國內有關轉移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a、miR-345水平對其預后的預測價值的研究報道較少，鑒于此，本文對98例接受同步放化且隨訪3年的轉移性中低位直腸癌患者的臨床資料進行回顧分析，探討外周血miR-29a、miR-345水平對轉移性中低位直腸癌同步放化療預后的預測價值，旨為臨床對此類患者擬定治療方案、改善預后提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年4月至2018年5月無錫市太湖醫院收治的98例接受同步放化療且受訪3年的轉移性中低位直腸癌患者為研究對象。其中男性57例，女性46例；年齡45～77歲，平均(56.74±5.13)歲。病例納入標準：①所有患者符合轉移性中低位直腸癌的診斷標準[9]，且經病理學證實；②卡氏(Karnofsky，KPS)評分≥70分；③均接受同步放化療治療；④肝腎功能正常者；⑤均為首次確診者；⑥3年隨訪資料完整。排除標準：①合并造血系統疾病者；②預計生存期≤3個月者；③合并其他類型惡性腫瘤者；④哺乳期或妊娠期女性；⑤合并精神系統疾病者；⑥患自身免疫疾病者；⑦合并急慢性感染性疾病者。

1.2 方法 依據隨訪3年結果，參照《臨床診療指南·腫瘤分冊》[10]中預后判定標準將患者分為預后良好組(無進展生存)45例與預后不良組(死亡或進展生存)53例。比較兩組患者血清miR-29a、miR-345水平及臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、合并基礎疾病、病理分型、組織學分化程度、原發灶腫瘤直徑、是否實施鞏固化療、臟器轉移個數數目、單個臟器轉移個數轉移腫瘤數目、同步放化療后血漿清蛋白水平差異。將上述差異有統計學意義的指標納入多因素logistic回歸分析患者同步放化療后3年內預后不良的影響因素。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲線，以曲線下面積(area under the curve，AUC)分析患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯合檢測對同步放化療后3年內預后的預測價值。

1.2.1 同步放化療方案 放療：采用CT進行模擬定位，隨后勾畫腫瘤靶區(gross tumor volume，GTV)(影像學、腸鏡確診的直腸腫瘤區域)；臨床靶區(clinical target volume，CTV)，包括淋巴結引流區域與原發病灶，具體為骶前區、直腸系膜區域、盆腔側壁、坐骨直腸窩等區域，真骨盆內緣為CTV側界，肛管下緣與L5椎體分別為CTV下界與上界，骶骨皮質后緣與膀胱后壁1/4～1/3分別為CTV后界與前界；計劃靶區(planning target volume，PTV)為CTV外擴0.5～1 cm。GTV區域劑量為50 Gy，PTV處方劑量為45 Gy，每次1.8～2.0 Gy，1次/天，5次/周，持續放療5周，期間口服卡培他濱(國藥準字H20123425，連云港潤眾制藥有限公司)825 mg/m2，2次/日，每周5天。鞏固化療：采用CapeOx方案(即奧沙利鉑+卡培他濱)治療。奧沙利鉑(國藥準字H20020648，成都長青制藥有限公司)130 mg/m2，靜脈滴注，大于2小時，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2，2次/天，口服，第1～14天，隨后休息7天，每3周重復1次。同步放化療完成后按照患者的個人意愿行鞏固化療。

1.2.2 外周血miR-29a、miR-345水平的檢測 采用實時熒光定量PCR測定外周血miR-29a、miR-345水平。同步放化療后采集所有患者全血標本4 mL，隨后通過TD-4M低速離心機(離心半徑為10 cm，離心轉速為3 000 r/min山東博科)分離血清，離心10 min后取上清液于-70℃條件下保存，通過miR試劑提取盒提取miRNA(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：DE-01001)，隨后采用Nanodrop2000分光光度計(上海在途生物科技有限公司)定量miRNA，采用miScript Reverse Transcription Kit反轉錄試劑盒(貨號：DXT-218061，上海科敏生物科技有限公司)，選擇1 μg RNA實施反轉錄反應，具體操作參照試劑盒，U6下游引物為5’-TCCTTTGAAACCTTGTGA-3’，上游引物為5’-ACGGTTAACCGTAATGCC-3’；miR-345下游引物:5 ’-GTGCACCGTCGCAGGT-3’，上游引 物 5’-GCTCAGTGCTACTCCA-3 ’；miR-29a下游引物為5’-GAAATCGGTTA-3’，上游引物為：5’-TAGCACCATCT-3’；隨后采用ABI7500 熒光定量PCR儀(美國生物系統公司)對miR-29a、miR-345進行擴增，以U6作為內參，采用2-ΔΔCt算法計算血清miR-29a、miR-345水平。

1.2.3 隨訪 以門診復查的形式進行隨訪，隨訪內容為患者是否死亡、轉移、復發，調查的資料及時錄入，資料錄入準確，保證數據的真實性，不可隨意篡改數據。每3個月隨訪1次，隨訪3年。以復發、轉移、死亡或隨訪時間截止為隨訪終點。

2 結果

2.1 預后良好組與預后不良組血清miR-29a、miR-345水平比較 同步放化療后，預后不良組血清miR-29a、miR-345水平高于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 預后良好組與預后不良組血清miR-29a、miR-345水平比較

2.2 患者預后不良的單因素分析 預后不良組患者組織學分化程度為低分化、原發灶腫瘤直徑≥5 cm、臟器轉移個數>1個、同步放化療時血漿清蛋白≤35 g/L例數占比均高于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 患者預后不良的單因素分析

2.3 同步放化療后3年內患者預后不良的Cox多因素分析 將組織學分化、原發灶腫瘤直徑、臟器轉移個數數目、同步放化療時血漿清蛋白、血清miR-29a、miR-345水平納入Cox比例風險回歸模型，賦值：低分化=1，中高分化=0；原發灶腫瘤直徑≥5 cm=1，原發灶腫瘤直徑<5 cm=0；同步放化療時血漿清蛋白≤35 g/L=1，血漿清蛋白>35 g/L=0；臟器轉移個數>1個=1，臟器轉移個數為1個=0；其余為連續變量。以轉移性中低位直腸癌同步放化療后3年內的預后情況為因變量(預后良好=0，預后不良=1)，Cox多因素分析顯示，臟器轉移個數>1個、同步放化療時血清miR-29a、miR-345水平為轉移性中低位直腸癌同步放化療后3年內預后不良的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 同步放化療后3年內患者預后不良的Cox多因素回歸分析

2.4 患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯合檢測對患者3年內預后的的預測價值 以同步放化療后3年內預后情況為因變量，對Cox多因素分析中有意義的miR-29a、miR-345采用ROC曲線分析各個指標的預測效能，ROC曲線結果顯示，患者同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯合檢測預測3年內預后不良的AUC值為0.740，高于血清miR-29a、miR-345單獨檢測的AUC值為0.687、0.667，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平單獨及聯合檢測對患者3年預后的預測價值

圖1 同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平

3 討論

近年來，雖然轉移性中低位直腸癌臨床治療水平不斷提高，但患者5年生存率仍然較低[11]。同步放化療可保留器官功能、避免手術創傷，且能夠盡可能殺死已經發生遠處轉移的癌細胞[12]。但部分轉移性中低位直腸癌患者行同步放化療治療的預后仍然不佳[13]。本文探討轉移性中低位直腸癌患者同步放化療后聯合檢測外周血miR-29a、miR-345水平對治療后3年預后的預測價值，旨為臨床擬定治療方案、改善預后提供參考依據。

本研究結果顯示，同步放化療后，預后不良組患者血清miR-29a、miR-345水平顯著高于預后良好組，表明預后不良的轉移性中低位直腸癌患者同步放化療后外周血miR-29a、miR-345水平高表達，與王華勝等[14]研究結果類似(預后不良的結腸癌患者miR-29a水平更高)，分析原因miR-29a、miR-345低表達與直腸癌患者腫瘤進展調控有關。同時本組資料顯示，臟器轉移個數>1個、同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平為轉移性中低位直腸癌同步放化療后3年內預后不良的影響因素。此結果與張令巧[15]、張弛等[16]發現的多器官轉移是轉移性結直腸癌預后不良的獨立危險因素的結果類似。同時，本組資料顯示，轉移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯合檢測對預測患者3年內預后的AUC顯著高于兩指標單獨檢測的AUC(P<0.05)，表明轉移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯合檢測對預測患者3年內預后較兩指標單獨檢測具有重要參考價值。相關研究指出，miR-29a在結直腸癌患者腫瘤轉移中發揮重要的調控作用，該作用主要針對上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，ETM)，其基本原理為先有效結合相應的靶點，從而來抑制E-鈣粘連蛋白表達，進而刺激EMT過程，同時該研究表明，有肝轉移患者體內miR-29a水平呈過表達狀態，可用于預測不良預后[17]。研究[18]指出，miR-345潛在的重要靶點為RUNX3、BBC3與CDKN1A，其中CDKN1A為一種周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑，可誘導細胞周期的停滯，miR-345可能是下調了CDKN1A的表達水平來促進結腸癌的進展。國外有研究[8]表明，miR-345可能作為預測局部晚期直腸癌患者放化療后療效的一種新型標志物。

綜上，轉移性中低位直腸癌同步放化療后血清miR-29a、miR-345水平聯合檢測對預測患者3年預后具有較高參考價值。鑒于本研究選取的樣本量不大，本結果后續仍需要擴大樣本量來進一步驗證。