高分子聚合物用于siRNA遞送系統的研究進展

王富喜 鄧宏圖 王濱

濱州醫學院附屬醫院藥學部，濱州 256600

RNA干擾技術是借助分子生物學技術將外部治療性核酸分子例如小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）導入患者病原部位的靶細胞內，通過目的基因的沉默來對引發疾病的缺陷或者異?；蜻M行修正，從而實現預防或治療特定疾病的一種新興生物治療技術，目前主要針對某些病毒引發的機體感染、人體的部分癌癥以及多種遺傳引發的病癥等［1］。siRNA 藥物相比于傳統藥物，在某些疾病治療上展現出巨大優勢，即通過序列設計靶向基因，siRNA 可以達到治療疾病的目的，并且其合成工藝相對于抗體藥物更為簡單［2］。siRNA 的靶點特異性強，對于同一家族的激酶來說，小分子抑制劑往往會產生脫靶效應而產生不良反應，而使用siRNA 作為藥物，通過對序列的精確設計，可以使脫靶產生的可能性盡可能地降低［3］。siRNA 的優點是高效和特異性，但由于siRNA 進入體內后的不穩定性，因此在siRNA藥物的研發中其載體的構建越來越受到關注，以期提高siRNA 藥物穩定性及靶向性。本文將從siRNA 體內遞送存在的影響因素及遞送siRNA 的高分子聚合物載體的研究進展進行綜述。

siRNA體內遞送的障礙

雖然RNA 干擾等基因技術為臨床疑難雜癥的治療提供了不同于以往治療手段的新策略，但是這些策略無一例外均需要基因體內遞送。只有將治療基因有效遞送至患者病灶細胞內進行表達，才能達成預期治療目標，體外基因導入體內便要克服遞送過程中諸多的遞送障礙，臨床上多遇見的基因遞送障礙有以下幾種。

1、核酸酶降解

由于核酸攜帶負電荷以及自身尺寸大小限度，故而很難以游離方式直接通過細胞膜進入細胞內。而電穿孔、基因槍或直接注射靶細胞等方式雖然可以直接將目的基因注進核酸，然而，這些技術在體內傳遞方面存在局限性，如缺乏組織穿透、細胞和組織損傷誘導以及往往轉染效率很低。因此，需要更謹慎和高效的方法來實現siRNA 向腫瘤細胞的遞送。當靶部位不能局部確定時，通過靜脈給藥是首選的策略。同時，體內存在很多核酸酶，這些酶能夠短時間內降解人體內部循環中的游離核酸［4-5］。為解決核酸被破壞問題，化學修飾的主干或寡核糖核苷酸的堿基已被用來保護siRNA，而不損害其結合靶信使RNA（mRNA）的能力，臨床研究發現，核酸帶負電荷的磷酸主鏈與帶正電的陽離子分子可以以靜電相互作用而發生絡合生成核酸絡合物，這種結構的絡合可以使得絡合物電荷呈近電中性，同時核酸分子結構被壓縮，從而改善核酸被酶降解［6］。

2、細胞攝取效率

基因遞送過程中，從細胞外進入細胞內應跨越一層含有類型數量大的糖蛋白的磷脂雙分子層結構細胞膜，細胞的攝取效率便往往影響了基因遞送的療效［7-9］。脂質體、高分子載體等包載siRNA 藥物載體納米顆粒進入細胞內主要借助吞噬和胞飲進行，不同納米粒（nanoparticles，NPs）進入細胞的方式均各不相同，應該選擇合適納米材料作為選擇基因遞送載體材料，同時對納米材料進行相應修飾，利用靶細胞所處微環境差異來提高細胞攝取效率［10-11］。

3、內涵體逃逸障礙

核酸絡合物進入細胞后，被囊泡包裹會和細胞器融合，形成內吞小泡，內吞小泡會逐步從早期內涵體轉化為晚期內涵體，直至成熟為溶酶體，這時溶酶體內環境的pH 值下降、消化酶類增加，為了使核酸絡合物免于被降解而失去療效，就要使核酸絡合物及時在溶酶體降解之前從內涵體從中逃逸出來并在細胞質中釋放［12-13］。

遞送siRNA的高分子聚合物載體

目前研究常見的基因表達載體主要有利用病毒來做載體和不利用病毒所制備的載體兩種類型。（1）病毒載體：病毒載體是將要導入的治療基因包裹在自然存在的病毒的外殼內，利用自然存在的病毒對人細胞感染性來將治療基因注入人體靶細胞。實驗中多用的病毒載體有逆轉錄型的病毒載體、腺病毒類的載體等［14-16］；（2）非病毒載體：非病毒載體是指借助高分子材料實現基因遞送，常用的該類載體有脂質體、樹枝狀大分子、非天然陽離子聚合物、天然多糖等［17-22］。

陽離子聚合物目前已是一類應用最為廣泛的非病毒型的基因載體，是絡合核酸如siRNA 的最有吸引力的生物材料，其作為基因載體的優勢較為明顯：（1）來源豐富，結構多樣；（2）容易修飾和多功能化；（3）生物相容性與體內可降解性較好等。直至如今，現有很多的陽離子聚合物被實驗發掘可在基因遞送中應用，并在進行進一步的研究。

1、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）

PEI 是一種聚合物載體，用于遞送核酸的研究較多。PEI是一種由胺基的重復單位和兩個碳脂族CH2CH2間隔體組成的水溶性高分子聚合物，因其結構中含有許多氨基基團，呈現出高密度的正電荷，具有強烈的“質子海綿效應”，促使其在一定pH 范圍內具有更好的絡合作用和pH 緩沖能力，使核酸免受溶酶體的降解，這也是其轉染效率較高的機理［23-24］。PEI 的獨特性能使其成為廣泛應用的 siRNA 遞送載體。但PEI 的一個顯著缺點是細胞毒性問題，其轉染效率相對來說雖然較高，但隨著分子量的增加和分支結構的增加，PEI 以線狀和分支狀的形式存在，其表現出的細胞毒性也有所增加。目前可知，線性或低分子量的PEI 與分支狀PEI 相比，轉染效率好，毒性低。也有報道稱，由于低分子量的PEI供siRNA結合的位點較少，結構穩定性無法在酸性環境下維持，使PEI 作為遞送載體的能力受到很大限制［25］。為減少其毒性，在不改變其物理和化學性質的基礎上，對PEI 進行各種修飾，以優化已與殼聚糖、透明質酸、環糊精、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等其他聚合物結合形成能保護siRNA 的NPs，形成促進內涵體逃逸的PEI 遞送載體。

殼聚糖是一種可生物降解、生物相容性好、無毒的聚合物，但對siRNA 轉染效率低。然而，殼聚糖與PEI 的偶聯可以緩解此缺陷。例如，Huh 等［26］研發的具有較好的生物相容性并可生物降解的乙二醇殼聚糖聚合物（GC）-PEI-siRNA NPs，其在體內表現出很強的腫瘤富集及靶向下調目標mRNA 的效應。Zhang 等［27］開發了一種雙靶向殼聚糖-PEI 納米系統TCPL/siRNA/PPF NPs，同時負載抗腫瘤藥物氯尼達明及siRNA。包裹的siRNA 靶向凋亡抑制蛋白Bcl-2，同時納米粒被一層聚乙二醇-聚（丙烯酸）-葉酸［PEG-Poly（acrylic acid）-folic acid］覆蓋，以延長循環、增強腫瘤細胞靶向性，同時載體將線粒體靶向配體三苯基膦加入殼聚糖-PEI 聚合物中，在體外也顯示出了顯著的抗腫瘤效應。

HA 是一種由D-葡萄糖醛酸與N-乙酰D-葡萄糖胺（NAG）二糖單元交替組成的多糖，其是細胞外基質（ECM）和滑膜液的組成部分，是帶負電荷的、可生物降解的、無毒的、無免疫原性的，并已被用于靶向CD44，顯示出了顯著的抗腫瘤效應。Ganesh等［28］開發了HA-PEI/PEG NPs，攜帶靶向SSB 和PLK1 蛋白的siRNA，在異種移植瘤模型中顯示了siRNA 具有體內活性。此外，siRNA 的沉默效率高度依賴于腫瘤的血管化，這表明腫瘤部位的積累并不僅僅是由靶向配體HA介導的。

CD 是一個由α-1，4 糖苷鍵連接的葡萄糖亞基組成的大環環寡糖。β-CD 納米系統的特點是內部疏水，外部親水，它們被用于增強負載疏水藥物的藥代動力學特性，其與siRNA 已成為協同藥物傳遞的理想候選載體。有研究開發了一種吸附在金納米棒上的CD-PEI偶聯物，用于多西他賽（docetaxel，DTX）與靶向p65 蛋白的 siRNA 共同遞送，結果表明，p65 抑制核因子-κB 通路及其下游級聯反應，增強了DTX效應，抑制了體內腫瘤的生長［29］。

2、多聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）

與PEI 類似，PLL 也是被廣泛用于核酸傳遞的納米載體。PLL 比PEI 具有更好的生物相容性和生物降解性。然而，PLL/siRNA 和PLL-PEG/siRNA 多聚物更容易與血清蛋白相互作用，降低了其沉默靶mRNA 的能力。研究表明，血清白蛋白和其他聚陰離子可以與siRNA 競爭結合PLL，導致顆粒不穩定性和siRNA 解體。有趣的是，鎖相環衍生物能夠通過提高血清穩定性來緩解這一缺點。例如，聚己內酯（polycaprolactone，PCL）已 被 用 于 開 發 一 種 新 型PEG-PCL-PLL 聚合物，它能夠結合siRNA 并形成膠束。該制劑的體外沉默效率與lipofectamine 2000 相似，優于PEI［30］。

PLL 還利用其優異的光熱特性與生物相容性與黑色素結合。黑色素在近紅外照射下產生熱量，這可能被用來促進siRNA 內涵體逃逸。生成的黑色素-PLL 聚合物負載以存活蛋白（survivin）為靶點的siRNA，在體內和體外均對4T1 腫瘤細胞生長有很強的抑制作用，同時與對照組相比，能夠明顯抑制小鼠肺轉移瘤的進展［31］。研究表明，Wang等［29］開發了一種新型三嵌段聚合物，由聚天冬氨酸［N-（N’，N’-二異丙基氨基乙基）］（PAD）與PLL-PEG 結合組成。PAD 用于賦予聚合物的pH 值敏感性，從而增強siRNA 和阿霉素向腫瘤細胞的傳遞。載體通過負載抗腫瘤藥物阿霉素，以及靶向Bcl-2 的siRNA 誘導腫瘤細胞凋亡。HepG2/阿霉素荷瘤小鼠的生物分布分析顯示，注射6 h 后腫瘤部位出現NP 積累，24 h 時達到最大值，持續時間長達48 h。此外，負載阿霉素/siRNA 治療組與對照組相比，PAD-PEG-PLL NPs 能夠抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長并增加其生存時間，同時體外分析顯示，治療后Bcl-2 和Ki67 的表達減少，提示誘導細胞凋亡，減少細胞增殖，從而控制了荷瘤小鼠的腫瘤生長［32］。

3、聚乳酸-乙醇酸（polylactic-co-glycolicacid，PLGA）

PLGA 是一種安全的高分子聚合物，具有生物可降解性，廣泛用于包括siRNA 遞送在內的藥物的遞送。在細胞水平上，PLGA 容易通過內吞作用穿透細胞膜或促使siRNA進入細胞，并迅速釋放到目標位置，直到溶酶體降解siRNA。但有報道稱，單獨與siRNA 結合，可能受siRNA 陰離子電荷和極性的影響，PLGA 的封裝效率、藥物釋放和轉染效率都受到限制［30］。利用經過PEI 修飾的PLGA 納米微粒，提高了siRNA 的包封效率和釋放度，提高了siRNA 在聚合物中的保留性，促使siRNA釋放到細胞質中［33］。

siRNA 藥物是目前受到重點關注的新型藥物。理論上，它能沉默任何疾病相關基因的表達。這使其成為治療各種惡性難治性疾病（包括腫瘤等重大疾?。┑南Ｍ?。但它同時也存在血漿穩定性差、生物利用度低等問題。這已成為制約其應用的致命性缺點。如何將其有效地遞送至體內、提高其生物利用度，是目前亟須解決的問題，而尋找優良載體、合理設計遞送體系至關重要。目前關于siRNA 的遞送系統的開發研究越來越多，隨著研究的不斷深入，相信在不久的將來會設計出更多的siRNA 高分子聚合物遞送載體，在治療腫瘤疾病及多種疾病方面會有很大的貢獻。