雞源大腸桿菌ΔcpxR的構(gòu)建及生物學特性研究

劉志歡，宋雪艷，謝翠萍，陶夢珂，張魯星，李苗苗，劉建華

（河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450000）

禽致病性大腸桿菌可引起禽的多種大腸桿菌疾病，如氣囊炎、心包炎、敗血癥，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失，又因為其與引起新生兒腦膜炎的大腸桿菌和引起尿道致病性的大腸桿菌基因具有高度同源性，開展相關(guān)研究具有較強的公共衛(wèi)生意義［1-2］。大腸桿菌的血清型眾多，疫苗交叉保護性較差，需要藥物預防和治療，但是在不合理使用抗生素的情況下，極易導致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性。

細菌內(nèi)部存在著許多復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來應對周圍環(huán)境的變化，以適應生存。雙組分調(diào)控系統(tǒng)是組氨酸激酶活性的膜定位傳感器和細胞質(zhì)反應調(diào)節(jié)器組成的表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細菌耐藥性的有CpxAR、PhoPQ和BaeSR等［3-4］。CpxAR是典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，部分細菌還具有附屬調(diào)節(jié)蛋白cpxP，組氨酸蛋白激酶cpxA通過感受外界變化使自身磷酸化，再將信號傳導給反應調(diào)節(jié)蛋白cpxP［5］，從而使細菌適應外界環(huán)境。最早認為該系統(tǒng)作用于細菌膜結(jié)構(gòu)蛋白，后來又有研究發(fā)現(xiàn)，感知細菌膜表面的壓力信號，調(diào)控菌毛和分泌系統(tǒng)，有助于細菌快速適應環(huán)境，進而調(diào)控細菌的生存機制［6］。

本實驗室在大腸桿菌標準菌株中，成功構(gòu)建了cpxR基因缺失株，在此基礎(chǔ)上，本研究通過Red同源重組技術(shù)，構(gòu)建臨床雞源大腸桿菌E41 cpxR基因缺失株和回補株，比較與其野生株E41的部分生物學差異，從而為更好地研究雙組分系統(tǒng)在臨床耐藥菌株中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

雞源大腸桿菌E41由本實驗室分離鑒定，并進行全基因組測序（Genebank ID：CP069707.1）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pKD4是具有FRT位點的卡那霉素抗性基因的輔助性質(zhì)粒、pKD46經(jīng)L-阿拉伯糖誘導后能表達同源重組酶、pCP20用于消除FRT位點的卡那霉素抗性基因、pBAD/HisA用于構(gòu)建回補株中的過表達載體，具有氨芐青霉素抗性，以上質(zhì)粒由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國OMEGA試劑公司；PrimeSTAR Max Premix、限制性核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA Ligase購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖購自北京索萊寶科技有限公司；PCR儀購自蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司；電轉(zhuǎn)化儀和電泳儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)E41中cpxR基因及其上下游序列設(shè)計相關(guān)引物。P1、P2作為打靶片段引物，5′末端的部分序列與cpxR兩側(cè)序列同源，3′末端部分序列與pKD4中kanr基因兩側(cè)序列互補；P3、P4為缺失鑒定引物；P5、P6為檢測重組子菌株插入的kanr基因；另外，組合引物P3和P5驗證kanr基因插入位點上游片段，約1700 bp；組合引物P4和P6驗證kanr基因的插入位點下游片段，約1300 bp；P7、P8擴增cpxR的全基因長片段；P9、P10是帶有雙酶切位點的完整開放閱讀框。

表1 本研究所用引物

1.4 cpxR基因缺失株構(gòu)建

參考Red同源重組方法［8］，將pKD46質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)入到E41感受態(tài)細胞中，得到E41-pKD46。以pKD4質(zhì)粒為模板，引物P1、P2擴增，膠回收得到cpxR基因的打靶片段。將打靶片段電轉(zhuǎn)到E41-pKD46感受態(tài)細胞中，過夜培養(yǎng)挑取陽性克隆子ΔcpxR:kan。然后將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到陽性克隆子中，擴增培養(yǎng)后，用缺失鑒定引物鑒定克隆子，并送測序。陽性克隆子鑒定并命名為ΔcpxR。

1.5 cpxR基因回補株構(gòu)建

以E41的DNA為模板，引物P7、P8擴增cpxR的全基因長片段。再以PCR產(chǎn)物為模板，用P9、P10引物擴增含有Sac I和Hind III雙酶切位點的cpxR完整開放閱讀框。對PCR產(chǎn)物和pBAD/HisA質(zhì)粒分別進行雙酶切。膠回收酶切產(chǎn)物，然后用T4 DNA Ligase 4 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物用化學轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細胞中，提取重組子質(zhì)粒雙酶切驗證。將陽性克隆子電轉(zhuǎn)到ΔcpxR感受態(tài)細胞中，即得到回補菌株CΔcpxR。

1.6 生長曲線和運動能力測定

分別挑取E41、ΔcpxR、CΔcpxR單菌落培養(yǎng)至D600=0.6，以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到肉湯中，37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定D600值。待D600=1.0左右時，各取5 μL菌液垂直滴加在含有0.5%瓊脂的半固體LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，測量菌圈直徑。

1.7 生物被膜形成能力測定

將新鮮菌液稀釋至D600=0.1［9］，取200 μL加入到96孔培養(yǎng)板中，28 ℃培養(yǎng)48 h。小心棄去培養(yǎng)基，用PBS輕洗3次后加入200 μL的結(jié)晶紫溶液染色20 min。棄去結(jié)晶紫溶液，用去離子水清洗3遍，然后用95%乙醇充分溶解，在酶標儀上測定D580的值。

1.8 缺失株穩(wěn)定性測定

挑取缺失株ΔcpxR單菌落于LB肉湯中［10］，每隔5 d傳一次代，一直持續(xù)15 d。將每次傳代的菌液提取DNA，用缺失鑒定引物P3、P4擴增后，電泳檢測缺失株ΔcpxR穩(wěn)定性。

1.9 各菌株MIC的測定

根據(jù)微量肉湯稀釋法［11］測定12種常用抗菌藥物對E41、ΔcpxR、CΔcpxR的最小抑菌濃度。以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，每個平行重復3次。在37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h，觀察結(jié)果，讀取最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失株ΔcpxR的鑒定

分別用缺失鑒定引物P3和P4、P5和P6，組合引物P3和P5、P4和P6進行PCR擴增驗證，均出現(xiàn)預期大小的目的條帶（圖1），將得到的重組子標記為ΔcpxR:kanr，再以ΔcpxR:kanr、ΔcpxR的DNA為模板，缺失鑒定引物P3、P4擴增cpxR基因，得到符合大小的目的條帶（圖2），表明成功構(gòu)建出缺失株ΔcpxR。

圖1 菌株ΔcpxR:kanr的PCR鑒定結(jié)果

圖2 菌株ΔcpxR和臨床野生株E41的PCR鑒定結(jié)果

2.2 回補株CΔcpxR的鑒定

將cpxR的完全開放閱讀框連接到pBAD/HisA載體并通過化學轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，提取重組子質(zhì)粒，進行雙酶切驗證，證實得到cpxR-pBAD/HisA重組質(zhì)粒（圖3）。將陽性克隆子電轉(zhuǎn)到ΔcpxR感受態(tài)細胞中，即得到回補菌株CΔcpxR。

圖3 cpxR重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 生長曲線和運動性測定

E41、ΔcpxR、CΔcpxR在37 ℃、200 r/min的情況下震蕩培養(yǎng)，每隔1 h測D600的值，繪制成圖4。用游標卡尺測量各菌株在半固體LB瓊脂上的菌圈直徑，繪制成圖5。上述結(jié)果顯示，cpxR基因缺失不影響E41的生長速度和運動能力。

圖4 各菌株生長曲線

圖5 各菌株的運動距離

2.4 生物被膜形成能力

在最適溫度28 ℃中培養(yǎng)48 h后，用酶標儀檢測D580處的吸光度。根據(jù)測定結(jié)果繪制成圖6。結(jié)果顯示，cpxR基因缺失對其生物被膜的形成能力影響不顯著。

圖6 生物被膜形成能力測定

2.5 缺失株穩(wěn)定性

利用缺失鑒定引物擴增傳代缺失株，不同時間傳代菌株均可擴增出目的條帶，未發(fā)生異常突變，表明缺失株具有良好的傳代穩(wěn)定性。

圖7 缺失株穩(wěn)定性測定

2.6 cpxR基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊?/h3>

根據(jù)歐盟藥敏試驗標準判定實驗結(jié)果，結(jié)果顯示，與E41相比，缺失株ΔcpxR對鏈霉素和多西環(huán)素的MIC值提高2倍，對氟苯尼考的MIC降低至原來的1/2。回補株CΔcpxR對多西環(huán)素和氟苯尼考恢復至E41一致水平。以上結(jié)果表明，cpxR基因參與了細菌對以上藥物敏感性的調(diào)控。

表2 各菌株對抗生素的MIC測定結(jié)果 μg/mL

3 討論

雞源大腸桿菌主要引起家禽呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病，也會與其他病原菌共同作用，造成家禽混合感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。人們發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控系統(tǒng)參與了感染過程，如雙組分調(diào)控系統(tǒng)、群體感性系統(tǒng)以及外排泵系統(tǒng)等。其中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)可以感應外界環(huán)境變化，通過激酶和響應調(diào)節(jié)器傳導相關(guān)信號，調(diào)節(jié)細菌生理代謝、應激反應和致病性等［12］，有利于細菌生存。作為典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，CpxAR雙組分調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控革蘭氏陰性桿菌的細胞膜抗逆性、細胞壁完整性、細菌耐藥性及調(diào)控毒力基因［13-15］。本研究利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建cpxR基因缺失株和cpxR回補株，探究cpxR基因?qū)η菰创竽c桿菌的生物學特性和耐藥性的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，cpxR基因的缺失不影響雞源大腸桿菌的生長速度、運動能力以及生物被膜形成能力。馮芬芬［16］發(fā)現(xiàn)cpxR基因的缺失不影響副豬嗜血桿菌的生長速度和生物被膜形成能力，另外，吳同壘等［17］發(fā)現(xiàn)缺失cpxR基因不影響沙門菌的生長速度。Matter等［18］在研究中指出，高水平的磷酸化cpxR可能抑制鞭毛和運動基因的轉(zhuǎn)錄，當cpxR基因缺失時，這種抑制作用就得不到表達，導致缺失株和回補株在運動能力、生物被膜形成能力上無明顯差異，本研究的結(jié)果與以上結(jié)果基本一致。

cpxR基因可以影響細菌對某些藥物的敏感性，例如當沙門菌缺失cpxR基因后，對氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性升高［19］。在本次研究中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，cpxR基因缺失后，對鏈霉素敏感性發(fā)生了變化。Masi等［20］認為CpxAR雙組分系統(tǒng)調(diào)控的外膜蛋白受到了影響，因此氨基糖苷類藥物鏈霉素的敏感性發(fā)生了變化。Kurabayashi等［21］研究發(fā)現(xiàn)cpxR基因參與了細菌對磷霉素的調(diào)控，認為缺乏磷酸酶活性的cpxA突變體會激活cpxR導致磷霉素耐藥，對多西環(huán)素和氟苯尼考敏感性的機制還需進一步探究。

通過對野生株E41、缺失株ΔcpxR、回補株CΔcpxR的比較，發(fā)現(xiàn)cpxR基因的缺失不影響野生株E41的生物學特性，但是影響了對抗生素的敏感性。本研究成功構(gòu)建了雞源大腸桿菌cpxR基因缺失株，為接下來在臨床野生株中構(gòu)建其他基因缺失株提供參考，也為后續(xù)研究cpxR基因功能提供了工程菌株。