楊梅素對(duì)脫礦牙本質(zhì)再礦化及樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接效果的影響

王貝貝，韓 菲，袁曉君，陳 晨，謝海峰

黃酮類(lèi)物質(zhì)是一種多羥基類(lèi)化合物，生物安全性高，作用范圍廣，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗菌和鎮(zhèn)痛作用，其中的特征性基團(tuán)酚羥基(—OH)可以與生物大分子(如膠原的羥基、羧基、氨基和酰胺基)之間形成氫鍵而有效結(jié)合在一起，并促進(jìn)膠原交聯(lián)，提高穩(wěn)定性；還可以形成離子鍵和共價(jià)鍵，與金屬陽(yáng)離子(如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+)發(fā)生螯合，這可能為促進(jìn)牙本質(zhì)膠原再礦化提供了必要條件[1-5]。楊梅素(myricetin，MYR)是天然黃酮類(lèi)化合物中的一種，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MYR與成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞之間具有良好的生物相容性，還可介導(dǎo)牙本質(zhì)膠原交聯(lián)，在臨床環(huán)境中有效地穩(wěn)定樹(shù)脂-牙本質(zhì)混合層，降低深層裸露的膠原纖維被降解的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。MYR是否對(duì)脫礦的牙本質(zhì)具有再礦化活性尚未見(jiàn)研究報(bào)道，本研究通過(guò)評(píng)價(jià)MYR對(duì)脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)的再礦化效果及其對(duì)牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)PJ2022-076-001)，于2021年7月—8月在口腔頜面外科門(mén)診收集新鮮拔除、無(wú)齲壞的第三磨牙，并保存在0.01%疊氮化鈉溶液中。流動(dòng)水冷卻下用低速金剛砂切割機(jī)(Isomet 1000，Buehler，美國(guó))獲取1 mm厚的中層牙本質(zhì)，后用高速手機(jī)制備大小為5 mm×7 mm的牙本質(zhì)樣本，使用牙科顯微鏡(OMS2350，Zumax，中國(guó))仔細(xì)檢查所有牙本質(zhì)表面，以確保沒(méi)有殘留的牙釉質(zhì)或牙髓。每個(gè)樣本表面用600目碳化硅砂紙濕拋光30 s，形成標(biāo)準(zhǔn)的玷污層。

1.2 溶液配制

再礦化溶液(SBF)按照Chen等[8]的方法制備，將含鈣溶液和含磷溶液混合，其中含鈣溶液包括20 mmol/L CaCl2、18 g/L NaCl、14 g/L Tris和700 μg/mL PAA；含磷溶液包括12 mmol/L Na2HPO4，上述產(chǎn)品均來(lái)自中國(guó)麥克林公司。將新鮮配制的SBF溶液放置4 ℃保存?zhèn)溆茫４鏁r(shí)間<1個(gè)月。

MYR溶液配制：將MYR(麥克林，中國(guó))溶于無(wú)水乙醇中，制備成600 μmol/L的MYR溶液。

1.3 分組處理

根據(jù)有無(wú)MYR預(yù)處理和再礦化處理將樣本分為空白對(duì)照組(CON組)、陰性對(duì)照組(POS組)和實(shí)驗(yàn)組(MYR組)。①CON組：35%的磷酸凝膠(格魯瑪，德國(guó))酸蝕樣本15 s，部分脫礦后浸泡在蒸餾水中2 d；②POS組：35%的磷酸凝膠酸蝕樣本15 s，去離子水預(yù)處理30 min后進(jìn)行再礦化處理，即將樣本在SBF中培養(yǎng)2 d，放置在37 ℃、100 r/min搖床上，每天更換SBF；③MYR組：35%的磷酸凝膠酸蝕樣本15 s，MRY溶液預(yù)處理30 min，再礦化處理同POS組。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察及化學(xué)表征

各組中隨機(jī)選取5個(gè)樣本進(jìn)行掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析，選取表面形態(tài)較好的樣本提交X射線(xiàn)衍射(X-ray diffraction，XRD)和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)分析。

將各組樣本在流動(dòng)水下徹底沖洗干凈以去除表面未結(jié)合的物質(zhì)，空氣中充分干燥后在SEM(MAIA3 TESCAN，捷克)下觀察，參數(shù)如下：預(yù)先噴鉑金，背散射電子模式，20 kV加速電壓，工作距離約5 mm。

XRD檢測(cè)樣本在射線(xiàn)衍射儀(D8 ADVANCE，Bruker AXS，德國(guó))上進(jìn)行，工作電壓為40 kV，電流為200 mA。在室溫下使用Ni過(guò)濾的CuK(λ=1.541 8?)輻照，步長(zhǎng)=0.02°，描速速率為1°/min，掃描范圍2θ=20°～60°，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

ATR-FTIR檢測(cè)樣本采用配有鉆石晶體衰減全反應(yīng)附件的分光光度計(jì)(Nicolet 5700FTIR，Nicolet，美國(guó))，光譜采集范圍為800～1 800 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次，獲得的光譜使用Origin 2021軟件對(duì)其進(jìn)行平滑、基線(xiàn)校正和歸一化處理。

1.5 納米滲漏實(shí)驗(yàn)

將處理后的各組樣本按產(chǎn)品說(shuō)明將粘接劑(Single Bond 2，3M ESPE，美國(guó))涂布在表面，光固化燈下固化10 s，然后將復(fù)合樹(shù)脂(3M ESPE，美國(guó))分兩層堆置到涂布粘接劑的牙本質(zhì)表面上，每層2 mm，牢固壓實(shí)并光固化40 s，獲得樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接樣本。將每組樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接樣本在37 ℃的蒸餾水中保存24 h。使用低速切割機(jī)垂直粘接界面切取橫截面為1.0 mm×1.3 mm的粘接試件。各組中隨機(jī)選取3個(gè)柱狀試件在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的銀氨溶液中避光放置24 h后，將試件取出用流動(dòng)水洗凈，置于顯影液中，在熒光燈下照射8 h，結(jié)束后試件再次用流動(dòng)水沖洗。依次使用1 200、1 500、2 000、2 500、3 000目碳化硅砂紙進(jìn)行打磨拋光。在使用一種目數(shù)砂紙拋光后，超聲清洗15 min。拋光結(jié)束后，試件常規(guī)干燥24 h后噴金處理。SEM在20 kV的加速電壓下以背散射模式進(jìn)行觀察。

1.6 微拉伸強(qiáng)度(micro tensile strength，μTBS)檢測(cè)

按照1.5中的方法制備獲得樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接樣本，在樣本中心部位使用低速切割機(jī)切割獲得橫截面為1 mm×1 mm的粘接試件，在萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(Instron 3365 ElectroPuls，Instron，美國(guó))上進(jìn)行μTBS測(cè)試。粘接試件以1 mm/min的速度進(jìn)行拉伸直至試件斷裂，記錄最大載荷。μTBS值=試件斷裂時(shí)的最大載荷÷粘接面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算各組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 21.0軟件對(duì)μTBS進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SEM形態(tài)學(xué)觀察

CON組牙本質(zhì)表面的牙本質(zhì)小管保持完全開(kāi)放狀態(tài)，牙本質(zhì)小管側(cè)壁上膠原纖維形態(tài)暴露，甚至出現(xiàn)膠原纖維間縫隙；POS組牙本質(zhì)小管管腔內(nèi)及管壁膠原纖維周?chē)猩倭烤w形成，膠原形態(tài)變模糊，而MYR組牙本質(zhì)小管內(nèi)晶體沉積量進(jìn)一步增加，膠原纖維被礦物質(zhì)完全包裹，無(wú)明顯間隙出現(xiàn)(圖1)。

2.2 XRD和ATR-FTIR分析

各組樣本XRD結(jié)果如圖2所示，在2θ=25.90°、2θ=31.85°、2θ=32.28°和2θ=32.92°處有羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的典型衍射峰，分別為(002)，(211)，(112)和(300)衍射峰。

CON組牙本質(zhì)的(002)反射衍射強(qiáng)度與(211)反射衍射強(qiáng)度的比值為0.295，POS組和MYR組該值依次增大(0.363和0.424)，這表明HA的取向是沿c軸的。

2.3 納米滲漏

各組樹(shù)脂-牙本質(zhì)界面的典型納米滲漏圖如圖4所示。CON組混合層中有范圍較廣、密集且連續(xù)的銀離子沉積； POS組納米銀顆粒沉積的范圍減小且不連續(xù)；而MYR組混合層中顆粒沉積顯著下降，表現(xiàn)為少量分散沉積。

2.4 μTBS檢測(cè)結(jié)果

CON組、POS組和MYR組的μTBS值分別為(29.25±3.63)MPa、(36.65±3.16)MPa和(47.87±4.68)MPa，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)使用全酸蝕系統(tǒng)對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行表層脫礦處理，研究了MYR作為牙本質(zhì)膠原交聯(lián)劑，是否可以通過(guò)非經(jīng)典再礦化過(guò)程——聚合物誘導(dǎo)液體前體(polymer-induced liquid precursor，PILP)的方法促進(jìn)礦物質(zhì)重新沉積在裸露的膠原纖維周?chē)M(jìn)而改善樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度。PILP是目前公認(rèn)的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)發(fā)生仿生再礦化的方法，與傳統(tǒng)的由上至下的再礦化理論不同，PILP是一種由下而上的非經(jīng)典再礦化方法，是納米級(jí)無(wú)定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)顆粒滲透至脫礦牙本質(zhì)深層，并自發(fā)沉積至膠原纖維內(nèi)和膠原纖維間，而非依附于種子晶體的再礦化過(guò)程[9-12]。據(jù)報(bào)道， 膠原纖維和殘留的HA晶種雖有助于吸收鈣離子和磷離子，但再礦化發(fā)生的速度較慢，4周后，表面也只有少量的礦物沉積[13]。因此采取加快再礦化進(jìn)程的措施是極其重要的。

基于Baldion等[6]對(duì)MYR的研究，本實(shí)驗(yàn)選用了600 μmol/L作為MYR實(shí)驗(yàn)濃度，在此濃度下，MYR可以維持成牙本質(zhì)細(xì)胞的活性，并可達(dá)到與其他基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制劑(如原花青素和乙二胺四乙酸)相似的抑制作用，穩(wěn)定膠原，在一定程度上改善樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度，但對(duì)脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)再礦化有何作用，目前尚不可知。

本研究觀察到MYR預(yù)處理后，脫礦牙本質(zhì)再礦化有更多的HA形成，說(shuō)明MYR對(duì)再礦化有促進(jìn)作用。MYR是含有多個(gè)—OH的單分子化合物，可滿(mǎn)足與牙本質(zhì)膠原纖維發(fā)生結(jié)合的同時(shí)利用游離—OH吸引礦化液中的鈣離子，加速礦物質(zhì)形成，使深層裸露的牙本質(zhì)膠原纖維得以在較短的時(shí)間內(nèi)重新被無(wú)機(jī)物包裹，膠原纖維間縫隙減少[6，14]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

納米滲漏結(jié)果顯示再礦化處理后的樣本納米滲漏量有所減少，使用MYR預(yù)處理后可進(jìn)一步減少。納米滲漏量的下降意味著混合層膠原纖維周?chē)肿淤|(zhì)量的減少，而水分子是直接導(dǎo)致或通過(guò)激活MMPs間接導(dǎo)致膠原降解并破壞樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接效果的“催化劑”[15-16]。ACP顆粒可以滲透至膠原纖維內(nèi)部和膠原纖維間并在滲透差的作用下置換出水分子[17]，而MYR則以氫鍵結(jié)合的方式代替膠原纖維上或周?chē)慕Y(jié)合水或游離水，并由于本身的疏水性能避免了水的滲入，形成一道膠原纖維的保護(hù)屏障[6]。

為了進(jìn)一步觀察MYR對(duì)樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接性能的影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了μTBS測(cè)試實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，再礦化處理有提高樹(shù)脂-牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度的作用，而MYR溶液預(yù)處理則可以進(jìn)一步增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接失敗的原因主要是混合層的破壞。混合層深層的膠原纖維無(wú)法被樹(shù)脂單體完全包裹而裸露，其機(jī)械性能較差，且易受到水和MMPs的攻擊[16，18]。本研究中，MYR預(yù)處理后脫礦樣本再礦化膠原纖維被礦物質(zhì)完全包裹，無(wú)明顯間隙出現(xiàn)，MYR通過(guò)促進(jìn)礦物質(zhì)對(duì)裸露膠原纖維的沉積包裹而產(chǎn)生保護(hù)作用，增加了混合層的機(jī)械強(qiáng)度，提高了μTBS值，明顯改善了樹(shù)脂-牙本質(zhì)的粘接效果。

此外，本實(shí)驗(yàn)中MYR溶液采用的溶劑是無(wú)水乙醇，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇可逐步脫水和產(chǎn)生水置換，減少膠原基質(zhì)中的水分子，從而保護(hù)膠原，這和MYR的結(jié)合及ACP顆粒的沉積有協(xié)同作用[19]。

綜上，MYR可有效促進(jìn)混合層牙本質(zhì)膠原纖維再礦化的發(fā)生并改善樹(shù)脂-牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度。