高效液相色譜-串聯質譜法同時測定3種N-亞硝胺類基因毒性雜質*

徐艷梅，韓彬，郝麗娟，高燕霞

(河北省藥品醫療器械檢驗研究院，石家莊 050011)

基因毒性雜質又稱遺傳毒性雜質，是指能夠對DNA產生直接或間接損害的化合物，而這種損害可能導致癌癥或基因突變[1-3]。即便是痕量基因毒性雜質，也能夠嚴重危害人類健康，從而造成不可逆損傷[4]。因此，為保證用藥安全，嚴格控制藥品中基因毒性雜質已成為重中之重。

藥物合成、生產及儲存過程中，都可能產生基因毒性雜質，質量控制稍有不當，就會對臨床應用產生不良后果。在眾多基因毒性雜質中，N-亞硝胺類化合物最常見，也是世界公認的強致癌物質[5-6]。沙坦類藥物在合成過程中涉及硝化、烷基化等反應，可能引入N-亞硝胺類基因毒性雜質(圖1)。自纈沙坦檢出N-亞硝胺類基因毒性雜質后，沙坦類藥物中的基因毒性雜質就受到藥品監管部門及公眾的高度關注，藥品生產企業也更加注重沙坦類藥物中基因毒性雜質的控制。N-亞硝胺類基因毒性雜質的檢測方法有很多，如高效液相色譜(HPLC)[7-8]、液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[9-11]、氣相色譜(gas chromatography，GC)[12]、氣相色譜-串聯質譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)[13-14]等。

A.厄貝沙坦；B.N-亞硝基乙基異丙胺；C.N-亞硝基二異丙胺；D.N-亞硝基二丁胺。

隨著LC-MS/MS技術的迅速發展，該技術被廣泛應用于N-亞硝胺類基因毒性雜質檢測。筆者在本研究建立同時檢測厄貝沙坦原料藥中N-亞硝基乙基異丙胺(N-nitrosoethyl isopropylamine，NEIPA)、N-亞硝基二異丙胺(N-nitroso diisopropylamine，NDIPA)和N-亞硝基二丁胺(N-nitroso dibutylamine，NDBA)的LC-MS/MS方法，并進行方法學驗證。該方法簡單，快速，靈敏度高，準確性強，適用于厄貝沙坦原料藥中基因毒性雜質的檢測，可為其質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司，配置LC-20AT二元泵)；Triple Quad 6500質譜儀(美國AB SCIEX公司)；XS105型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 厄貝沙坦原料藥(購于河北龍海藥業有限公司，批號：S20200201，S20200202，S20200203)；NEIPA對照品(批號：XH20-2477，含量：100%)、NDBA對照品(批號：XH20-2478，含量：100%)、NDIPA對照品(批號：XH20-2479，含量：100%)購于HIC公司；甲醇和甲酸為LC-MS級(Merck公司)；水由屈臣氏提供。

2 方法與結果

2.1LC-MS條件[15-16]

2.1.1LC條件 色譜柱為Agilent 120 PFP (100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。采用梯度洗脫：0～3 min，90%B；3～5 min，90%→2%B；5～8 min，2%B；8～10 min，2%→90%B，最后以90%B平衡3 min；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃。

2.1.2MS條件 大氣壓化學電離(atmosphere pressure chemical ionization，APCI)源，采集模式為正離子，監測模式為質譜多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣流量35 mL·min-1。質譜檢測條件見表1。

表1 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質的質譜分析參數

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的配制 分別精密稱取NEIPA、NDIPA和NDBA對照品各25 mg，置25 mL量瓶，以20%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。

2.2.2混合對照品溶液的配制 分別精密量取“2.2.1”項對照品儲備液適量，置同一量瓶，加溶劑稀釋制成每毫升含NEIPA、NDIPA和NDBA均為100 ng的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的配制 稱取厄貝沙坦原料藥100 mg，置10 mL量瓶，加甲醇2 mL振搖使溶解，水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3專屬性考察 取空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。在該色譜條件下，NEIPA、NDIPA和NDBA保留時間分別為4.95，6.31，8.90 min，各峰之間分離度符合檢測要求，并相互不影響測定。結果見圖2。

A.空白溶劑；B.供試品溶液；C.混合對照品溶液。

2.4檢出限及定量限考察 精密量取混合對照品溶液，加溶劑逐級稀釋成不同濃度溶液。按“2.1”項色譜條件進樣分析，以信噪比(S/N)=3為檢出限，以S/N=10為定量限。結果顯示，NEIPA、NDIPA和NDBA檢出限分別為0.033 7，0.023 4和0.061 1 ng·mL-1，定量限分別為0.201 3，0.070 1和0.101 4 ng·mL-1。

2.5線性關系考察 精密量取混合對照品溶液0.02，0.1，0.2，0.5，1，5，10 mL，分別置10 mL量瓶，加溶劑稀釋至刻度，作為線性溶液。按“2.1”項色譜條件分別進樣分析，記錄色譜圖。以對照品溶液濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表2。實驗結果表明，NEIPA、NDIPA和NDBA在各自線性范圍內線性關系良好。

表2 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質的線性關系考察結果

2.6精密度實驗 精密量取對照品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣分析6次，記錄色譜圖。經計算，NEIPA、NDIPA和NDBA的RSD分別為1.3%，1.4%，2.0%，表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗 按“2.2.3”項配制供試品溶液，平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。重復測定6次，結果表明，該方法重復性良好。

2.8穩定性考察 取供試品溶液和對照品溶液，室溫下分別放置0，1，2，3，6，12 h后，按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果表明，對照品溶液和供試品溶液12 h內穩定。

2.9加樣回收率實驗 精密稱取供試品100 mg，共9份，置10 mL量瓶，分別加甲醇2 mL振搖使溶解，分別精密加入系列對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL各3份，溶劑定容至刻度，搖勻，按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。測得量與加入量比值即為回收率。結果見表3，經計算得NEIPA、NDIPA和NDBA平均加樣回收率分別為95.13%，92.00%和93.96%。

表3 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質加樣回收率實驗結果

2.10樣品測定 按“2.2”項對照品溶液與供試品溶液配制方法制備待測液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果3批樣品(批號：S20200201，S20200202，S20200203)均未檢測到基因毒性雜質NEIPA、NDIPA和NDBA。

3 討論

N-亞硝胺類基因毒性雜質濃度極低，因此為達到痕量分析測定要求，不僅需要克服靈敏度低、選擇性差的問題，還需要排除溶劑基質干擾大等因素影響。本實驗通過專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、重復性、加樣回收率及穩定性等進行一系列的方法學考察，證明了所建方法專屬性強、靈敏度高的特點，能夠滿足痕量N-亞硝胺類基因毒性雜質的定量檢測需求。

同時，本研究通過改變色譜分析條件，如流速、柱溫、流動相B的初始比例等，對本方法耐用性進行了考察，結果顯示，微調色譜分析條件后，3種基因毒性雜質的峰面積基本一致，說明3種N-亞硝胺類基因毒性雜質的測定量基本一致，表明本方法的色譜條件耐用性良好。

本研究建立的HPLC-MS/MS法簡單、快速、靈敏度高、準確性強、重復性好，適用于厄貝沙坦原料藥中基因毒性雜質NEIPA、NDIPA和NDBA同時測定，可為其質量控制提供參考，并為臨床用藥安全提供保障。